ปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิก และวิธีการแก้ไข

1. ปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิกปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิก และวิธีการแก้ไข • เทคนิคการวิเคราะห์ทางเคมีคลินิก • Photometry • Potentiometry (ion-selective) ปัญหา ผลของปัญหา หรือ ดัชนีแสดง วิธีการแก้ปัญหา • กำจัด/ลด ปัญหา • หรือยอมรับกรณีอยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้

2. ปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิกปัญหารบกวนการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิก และวิธีการแก้ไข วัตถุประสงค์การเรียน 1) อธิบายปัญหาที่อาจมีผลต่อการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิกและแนวทางการแก้ไขปัญหา 2) อธิบายวิธีการตรวจสอบการรบกวนของสารต่อการตรวจวิเคราะห์ทางเคมีคลินิก

3. Photometric measurement process ตวงปริมาตรผิด Slow decompose ตัวอย่างเสื่อมสภาพ น้ำยาเสื่อมสภาพ / สารทำปฏิกิริยาไม่พอ มีสารรบกวนปฏิกิริยาตรวจวัด สีของตัวอย่าง ความขุ่นของตัวอย่าง สารรบกวน ตัวอย่าง + น้ำยาตรวจวิเคราะห์ ปล่อยให้เกิดปฏิกิริยา • Chemical interference • Spectral interference • Electrical interference • Physical interference • (Matrix interference) End-point assay Kinetic assay วัดการดูดกลืนแสง บันทึก + คำนวณ + รายงานผล บันทึกผลผิด คำนวณผิด รายงานผิดคน วัดการเกิดปฏิกิริยา ในช่วงเวลาที่ไม่เหมาะสม

4. Mechanisms of Interference and Sources • ศึกษาเพิ่มเติมใน • Interferences in clinical chemistry analysis • Article in Indian Journal of Clinical Biochemistry http://www.springerlink.com/content/mx4051667207877h/fulltext.pdf • By Saibaba KSS, Bhaskar MV, et al. • Interference • From http://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/interf.htm • Interferences in Laboratory Testing • from http://ucsdlabmed.wikidot.com/chapter-1-1 Chemical artifacts. The interferent may suppress the reaction by competing for reagents or inhibiting indicator reactions. It could also alter the form of the analyte by complexation or precipitation.

5. Mechanisms of Interference Detection artifacts. The interferent may have properties similar to the analyte, such as fluorescence, color, light scattering, elution position, or electrode response that are detected and measured.

6. Mechanisms of Interference Physical artifacts. The interferent may alter a physical property of the sample matrix, such as viscosity, surface tension, turbidity, or ionic strength, causing an apparent change in measured analyte concentration.

7. Mechanisms of Interference Enzyme inhibition. The interferent may alter the activity of an enzyme (analyte or reagent) by sequestering metal activators, binding to the catalytic site, or oxidizing essential sulfhydryl groups. The interferent may also compete for a key substrate in an enzyme- based measurement procedure. For example, adenylate kinase competes with creatine kinase for ADP, and thus is measured falsely as creatine kinase in some measurement procedures.

8. Mechanisms of Interference Nonspecificity. The interferent may react in the same manner as the analyte.Although some differentiate nonspecificity from interference, its practical effects are the same to the laboratory. Some common examples: keto acids react in alkaline picrate creatinine measurement procedures; indoxyl sulfate reacts in some diazo bilirubin procedures.

9. ปฏิกิริยาตรวจวัด fructosamine Eneaminol Fructosamine NBT2+ NBT+ Formazan Reducing substances Problem:

10. ปฏิกิริยาตรวจวัด ALP p-nitrophenyl monophosphate + H2O p-nitrophenol + phosphate ALP, Mg2+, pH 10.4  Problem: • spontaneous liberated p-nitrophenol • negative feedback of phosphate ion

11. ปฏิกิริยาตรวจวัด glucose Problem: • non-enzymatic reaction of the secondary Rx. • oxidizing or reducing substances

12. Mechanisms of Interference Cross-reactivity. An interferent structurally similar to an antigen may “cross-react” with the antibody in an immunochemical measurement procedure. This is a form of nonspecificity. For example, caffeine is measured in some theophylline procedures. The degree of cross-reactivity is regarded as a measure of the specificity of an immunochemical method, but it is not a useful measure of its susceptibility to interference.

13. Mechanisms of Interference = aqueouse phase . = cells or nonaqueous substances Water displacement. Nonaqueous substances (protein, lipids) affect activity-based measurements by displacing aqueous plasma volume. These effects are not considered interference if it is desired to measure the analyte concentration as the concentration in plasma water.

14. ISE measurement process • ปัญหาของการตรวจวัด • สัญญาณอ้างอิงของการวัดศักย์ไฟฟ้า (ground) • ไม่คงที่ • การตอบสนองของ electrode (slope) • เปลี่ยนไปในระหว่างการตรวจวัด • สาเหตุ: • - ผิวของ selective membrane สกปรก • - electrode เสื่อม Ref Sample detector Cl K Na Sample flow Solving by Measurement Process 1.Samplemeasurement วัดศักย์ไฟฟ้าฟ้าของ sample เพื่อใช้ในการคำนวณค่า 2.Internalstandard / Reference solution measurementวัดศักย์ไฟฟ้าของ Ref. solution เพื่อตรวจสอบความคงที่ในการตอบสนองของ electrode และช่วยลด carry over ระหว่างตัวอย่าง For Checking - slope of electrode - Precision ผู้ใช้ต้องปฏิบัติเพื่อลดปัญหาการตรวจ Clean & De-protein the selective membranes and the chamber or capillary

15. ตรวจสอบสารรบกวนวิธีการตรวจวัดทางเคมีคลินิกได้อย่างไรตรวจสอบสารรบกวนวิธีการตรวจวัดทางเคมีคลินิกได้อย่างไร Analytical Interference of substances • Blank sample • Chemical added sample นำไปตรวจวัดและ วิเคราะห์ข้อมูล ตัวทำละลายที่ใช้เป็น blank sample ได้แก่ 1: pooled serum or plasma 2: 0.1 ml 0.25 N NaOH and 9.9 ml pooled serum or plasma 3: 0.1 ml 70% ethanol and 9.9 ml pooled serum or plasma Chemical added sample 1: สาร + pooled serum or plasma 2: 0.1 ml Chemical solution + 9.9 ml pooled serum or plasma ** ศึกษาเพิ่มเติมในเอกสาร: Interference and Recovery Experiments From: http://www.westgard.com/lesson27.htm Writhed by James O. Westgard, and Elsa F.Quam

16. หลังจากเตรียมตัวอย่างที่จะศึกษาได้แล้วให้นำมาตรวจวัดหลังจากเตรียมตัวอย่างที่จะศึกษาได้แล้วให้นำมาตรวจวัด A. Calibration of the method or system according to the recommendation of the manufacturerB. Measurement of the quality control materials (low and high)C. Pooled serum or plasma without the added chemical (blank sample) (n = 5)D. Five different pooled sera or plasmas with added chemical (n = 2)E. Pooled serum or plasma without added chemical (blank sample) (n = 5)F. Five different pooled sera or plasmas with added chemical (n = 2) and so on.

17. Percentages of original values

18. วิเคราะห์ dose response of the interference

24. Chemical Interference solving • Dilution Lower detection limit 1:2 dilution Interference Analyte

25. Chemical Interference solving • Interference removing Precipitation Extraction Adsorption Oxidation Detergent addition

26. Chemical Interference solving • Addition Lower detection limit Standard addition Interference Analyte

27. Chemical Interference solving • Increase specificity • -Enzymatic reaction • -Antigen –antibody reaction • -Selective membrane

28. Spectral Interference solving • Sample blank DW + Reagent Sample + Reagent Sample + Reagent’s Diluents Reagent blank Sample blank Unknown

29. Electrical interference solving • Grounding • Stabilizer

30. A A Electrical interference solving Bichromatic measurement Dichromatic measurement A Corrected = A1-A2 Absorbance A1 A2 1 2 Wavelength (nm) ช่วยทำให้การวัดค่า A correctedได้คงที่ กรณี reference signal เปลี่ยนแปลงไม่มาก

31. Physical interference solving • Dilution for optimum • viscosity and absorptivity

32. ปัญหา การตรวจวิเคราะห์ด้วย เครื่องวิเคราะห์สารเคมีอัตโนมัติ ที่ใช้หลักการวิเคราะห์แบบ photometry measurement

33. S1 - 0 As - ABk S1 - 0 As - ABk ทฤษฎีการคำนวณ ของ Beer & Lambert Law กรณีใช้เครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติ As AU1 ABk U1 S1 Reference signal 0 Cal Factor = ค่าขณะทำ Calibration • ใช้ได้นานเท่าไหร่จึงไม่เปลี่ยน ? • ถ้า cuvette ที่ใช้ทำ Blank มีปํญหา ? U1 = (AU1– ABk) x

34. Substrate depletion A log phase DA Lag pahse Time DT Lag time Interval reading Continuous-monitoring assay (Kinetic assay or Rate assay) 1st Read 2nd Read Two-point kinetic assay or Two-point rate assay Fixed-time for Reading End-point assay

35. 6 JULY 2003 ปฏิกิริยาตรวจวัด LDH (Kinetic) มีปริมาณคงที่ LDH L-lactate + NADH+ Pyruvate + NADH 340 nm A Substrate depletion reaction High Abs limit Initial rate DA/min limit Delta Abs limit blank Time Lag time Interval reading time

36. Incubation time A 7 reading at 30 seconds intervals Fast kinetics of DataProTM Least squares calculation 30 Correlation coefficient 0.9 - 1.0 : linear reaction 0.8 - 0.9 : suspect linearity < 0.8 : non linear 45 Slope --> DA/min มากกว่า Consumption limit(CL) Time (sec.) Lag time Interval reading time Sample + Reagent(s)

37. ข้อมูลจากเอกสารประกอบน้ำยาตรวจวัด ALT กรณี ความกว้าง cuvette = 1.0 cm ตั้ง initial rate หรือ consumption limit : 0.26 กรณี ความกว้าง cuvette = 0.5 cm ตั้ง initial rate หรือ consumption limit : 0.13

38. ข้อมูลจากเอกสารประกอบน้ำยาตรวจวัด ALT 0.57 x 450 = 256.5 mA/min = 0.2565 A/min = 0.26 A/min กรณี ความกว้าง cuvette = 1.0 cm ตั้ง initial rate หรือ consumption limit : 0.26 กรณี ความกว้าง cuvette = 0.5 cm ตั้ง initial rate หรือ consumption limit : 0.13

39. Bilirubin รบกวนการตรวจวัด Creatinine จะแก้ไขอย่างไร NaOH Creatinine + Picrate Bilirubin ลดอัตราการเกิด complex Non-creatinine substancesเพิ่มค่าดูดกลืนแสง  = 500-520 nm กรณีไม่ตกตะกอนโปรทีน น้ำยาควรมี detergent R1 (picric acid + NaOH) End-point Assay Kinetic Assay R1 : NaOH R2 : picric acid) ทำลายสารรบกวนได้ Lag time 60s Read time 60s Lag time 20s Read time 60s

40. ปัญหาสารรบกวนปฏิกิริยาตรวจวิเคราะห์ปัญหาสารรบกวนปฏิกิริยาตรวจวิเคราะห์ Enzyme Co-factor จากสารกันเลือดแข็ง Mg++ Zn++ NaF/K-oxalate tube F- เกาะกับ metal ion ได้ Oxalate เกาะกับ Ca++ รบกวนปฏิกิริยาตรวจ วิเคราะห์ที่ใช้เอนไซม์ Citrate tube เกาะกับ Ca++ EDTA-tube เกาะกับ Ca++ Lithium Heparin-tube Hemolysate serum/plasma Lipimic serum Icteric serum

45. กรณีศึกษา 1 ผลการตรวจวัดสารเคมีด้วยเครื่องวิเคราะห์อัตโนมัติที่ใช้หลักการ Photometry ได้ข้อมูลดังนี้

46. กรณีศึกษาที่ 2 ในการศึกษาการรบกวนของสาร Aต่อการตรวจวัด glucose ได้ปฏิบัติดังนี้ นำ pooled serum มาเตรียมตัวอย่างเพื่อศึกษาดังนี้

47. กรณีศึกษาที่ 3 การศึกษาผลของ Lithium heparin ต่อผลการตรวจ Chloride โดยเจาะเก็บเลือดแบ่งใส่หลอด Clot blood (ไม่มีสารกันเลือดแข็ง) และหลอดที่มี lithium heparin ในปริมาณที่เท่ากัน และนำไปปั่นแยก serum และ plasma มาตรวจวัด Chloride พร้อมกัน ได้ผลตรวจ Chloride ดังตาราง

48. ให้ช่วยกันวิเคราะห์ และ ตอบคำถามในแบบฝึกวิเคราะห์ และส่งก่อนวันที่ 24 ก.ค. 2555 • วันที่ 24 ก.ค. 2555 จะเลือกตัวแทนของกลุ่มมานำเสนอผลการวิเคราะห์และตอบคำถาม ผลงานใช้ประกอบการให้คะแนนเก็บในส่วนของ Report