생물리학 발표 PPT

1. 생물리학 발표 PPT Mass Spectrometry 시스템 생물학과 4학년정승연 시스템 생물학과 4학년 정승연

2. Mass Spectrometer http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm Quattro microTM LC-MS/MS system LCT Mass Spectrometer GCT Premier GC/MS Thermo Finnigan Trace GC/MS

3. http://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htmhttp://www.ucd.ie/cscb/main_pages/facilities/mass_spectrometry.htm http://en.wikipedia.org/wiki/File:Thermal_ionization_mass_spectrometer.jpg Thermal ionizationMS MALDI ToF

4. 이 기계는 초전도 자석 내에서 이온의 회전 주파수를 측정해 분자무게를 측정하는 장비로, 가장 가벼운 분자인 수소분자의 100만분 1의 무게 차이도 정확히 측정할 수 있는 초정밀 장비입니다. http://blog.daum.net/obk2030/16514054 한국기초과학지원연구원 – 15T FT-ICR MS’

6. Mass Spectrometry란 • MS, 질량분석법 • 전체 질량의 0.01%, Small organic molecule의 500만분의 1에 달하는 정확도 • 매우 높은 민감도 • 다양한 물질에 사용가능 –Proteins –Oligonucleotides –Oligosaccharides –Lipids –Others • Proteomics 에활용 * 단점 : 고가, 고 진공, 고전압, 높은 유지비 등이 있음

7. Mass Spectrometry의 과정 •   주입 시스템 : 먼저 시료를 도입한다. • 이온 발생원(Ionization source): 시료분자의 이온화, 더 작은 이온으로 쪼갬 • 질량 분리기(Mass analyzer): 이온을 질량 대 전하 비로 선택적 분리 • 검출기(Detector) : 이온 흐름을 그 양에 비례하는 전기적 흐름으로 전환, 증폭시켜 signal을 생성

8. Mass Spectrometry의 과정 Q. 분석하려는 시료를 이온화를하는가 ? Q. 진공시스템은 왜 필요한가 ?

9. MS 분류하기 Ion source 1. Electrospray Ionization(ESI) 액체 –Atmospheric Pressure Ionization (APCI) –Chemical Ionization (CI) –Electronic Ionization (EI) 2. Matrix Assisted Laser DesorptionIonization (MALDI) 고체 •  Mass Selection 3. Time of Flight(TOF) 4. Quadrupole –Magnetic Sector –Ion Trap –Ion Cyclotron •  Detector –Phosphor / Photo Diode 5. Multi-channel Plate (MCP)

10. Ionization의 종류 http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=777579&cid=559&categoryId=559

11. Ion source : ESI 분자량이 10만 이상인 폴리펩티트, 단백질, oligonucleotide • 1984 • 포름산 같은 산성 용액 사용 • (+)charge의 반발력 사용 • 보통 MS는 m/z가 1,500 이하인 곳에서 분해능이 뛰어나다. • ESI 방법을 사용하면 전하가 +2, +3, +4 등 전하가 높기 때문에 충분히 m/z가 1,500이하로 떨어져 분석할 수 있게 된다. ESI는 HPLC를 사용하여 직접 시료를 도입할 수 있는 장점이 있다. http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_esi.html

12. ESI의 특징 • 전자 분사 이온화 • 액체 상태의 시료를 이온화(LC-MS) • 기존의 방법으로는 얻기 힘들었던 intact 상태의 peptide나 단백질을 이온화 • 한 개 이상의 전하를 띤 이온을 생성

13. Ion source : MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) • 분자량이 수천에서 수만에 이르는 극성 생화학 고분자 화합물 • 1988년 독일과 일본 • MALDI 법은 매트릭스 물질과 분석 시료를 섞어 스테인리스 강 탐침 끝에 바른다. • 매트릭스는 레이저를 강하게 흡수하며 그 후에 매트릭스와 분석물은탈착되어 이온화된다. • MALDI 법은 분석기로 비행 시간(TOF)를 사용한다. http://www.magnet.fsu.edu/education/tutorials/tools/ionization_maldi.html

14. + + Laser + m m m a + a a m m m m + m a a a m matrix + analyte m Sample support • Ion source : MALDI Matrix와 sample을 약 1000~10000:1로섞어서 적당한 유기 용매에 혼합 혼합물을 시료용 plate에 올려놓고 진공 조건 만들어주면 유기 용매는 기화되고 시료는 matrix와 함께 균질하게 결정화 된다. 이 때 laser조사하면 에너지가 matrix를 통해 sample로 전달되어 약한 이온화가 일어난다. 전기장을 사용해서 이온들을 모으고 m/z에 따라 나누어 분석한다.

15. AH+ Laser • 1. Sample (A) is mixed with excess matrix (M) and dried • on a MALDI plate. • 2. Laser flash ionizes matrix molecules. • 3. Sample molecules are ionized by proton transfer from matrix: • MH+ + A  M + AH+. Sample plate hn Variable Ground Grid Grid +20 kV

16. The Mass Analyzer: TOF Time Of Flight(TOF) Ion Source Flight Tube 20-25 kV + +

17. + + The Mass Analyzer: TOF Ion Source Flight Tube Detector +

18. + + The Mass Analyzer: TOF Ion Source Flight Tube Detector +

19. Laser MALDI ionsource Ion reflector Iondetector HiRes mass spectrum The reflector focuses ion of same mass but different velocity on detector; high resolution is obtained

20. MALDI TOF의 특징 • 큰 분자량 물질을 분석 가능 (>400kDa) • 혼합물 분석 가능 • 미량 분석 가능(펩타이드의 경우 fmol분석 가능) • 데이터 분석 용이 • 염의 영향 덜 받음 • 비용 저렴, 빠른 시간 내에 가능 • 높은 throughput (>1000 sample/hour)

21. MALDI/TOF Mass spectrum

23. Calibration of the mass scale The mass-to-charge ratio of an ion is proportional to the square of its time of flight in the analyzer (“drift time”).

24. The Mass Analyzer:Quadrupole

25. The Mass Analyzer:Quadrupole

26. The Mass Analyzer:Quadrupole Quadrupole(Mass filter) • 4개의 금속 막대로이루어져 있으며, 한쌍(1,2)은 DC voltage, 다른 한 쌍(3,4)은 Radio frequency voltage가 가해진다. • Quadrupole의 막대는 각각 (+)와 (-)의 서로 반대되는 전하를 가진다. - 가해지는전압의 진폭은 선택된 m/z에 해당되는 ion만 ion source에서 detector까지 통과하게 한다. - Quadropole의 전압을 바꾸면서 주어진 mass범위의 이온을 scanning 한다.

27. Detectors : MCP MCP: Multiple-channel plate

28. + Ions are detected with a Microchannel Plate 처음 들어온 primary incident particle이 surface를 치거나, some material을 통과하게 되면 secondary particle의 방출이 유도된다. -1000 V -100 V D= 6-25 u Primary Ion from Flight Tube L

29. + Ions are detected with a Microchannel Plate -1000 V -100 V D= 6-25 u L

30. + Ions are detected with a Microchannel Plate -1000 V -100 V D= 6-25 u Multification by secondary emission e- Secondary emissive materials: Beryllium oxide, magnesium oxide etc L

31. + Ions are detected with a Microchannel Plate -1000 V -100 V D= 6-25 u e- e- e- e- L

32. + Ions are detected with a Microchannel Plate -1000 V -100 V D= 6-25 u e- e- e- e- L

33. e- e- e- e- e- e- e- e- + Ions are detected with a Microchannel Plate -1000 V -100 V Secondary particle이여기서와 같은 electron일 때 이것을 secondary electron emission이라고 한다. D= 6-25 u e- e- e- e- ~103 Amplification L

34. Tandem MS(MS/MS) MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법

35. Tandem MS(MS/MS) MS/MS : MS를 두 번 사용하는 방법 CID : collision induce dissociation – 1차적으로 생성된 이온이 collision cell 에서 가스 분자와 충돌하면 fragmentation이 발생한다.

36. Peptide Mass Fingerprinting • 단백질을 sequencing하는 분석 방법 • Protease를 사용하여 peptide를 잘게 쪼갠다. • 절단 후 발생하는 단편들을 질량 분석을 통하여 분석한다. • Mass measured with MALDI-TOF and ESI-TOF

37. Peptide Mass Fingerprinting • 분석 가능 장비 : Q-TOF, MALDI-TOF, ESI MS

38. Peptide Mass Fingerprinting

39. Peptide Mass Fingerprinting