N.K. Sana, I. Hossin, 1 E.M. Haque and Ranajit Kumar Shaha

1. IDENTIFIKASI, PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI LIPASE DARI PERKECAMBAHAN BIJI KANOLA (Brassica napus L.) N.K. Sana, I. Hossin, 1E.M. Haque and Ranajit Kumar Shaha Department of Biochemistry and Molecular Biology 1Department of Chemistry, University of Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladesh Windy Widowaty 20507015 Lipase (EC 3.1.1.3)

2. AGENDA PRESENTASI • PENDAHULUAN • Lipase • Aplikasi lipase pada industri • Biji Kanola (Brassica napus L.) • TUJUAN • METODE • HASIL DAN PEMBAHASAN • KESIMPULAN

3. LIPASE PENDAHULUAN • Lipase (triacylglicerol acylhydrolase, E.C. 3.1.1.3) adalah enzim yang terdapat dalam hewan, tumbuhan dan mikroorganisme yang mengkatalis hidrolisis dari ikatan ester gliserol dan mensintesis ester gliserol. • Aktivitas lipase terdapat pada jaringan tanaman yang sedang tumbuh terutama tanaman yang banyak mengandung triacylglycerol. • Aktivitasnya pada biji tanaman meningkat sangat cepat pada tahapan perkecambahan.

4. APLIKASI PENDAHULUAN • Penggunaan lipase dalam skala industri sangat berkembang. Lipase dapat digunakan untuk memproduksi asam lemak (Linder, M et al., 2002), biosurfaktan (Edmundo, C et al., 1998), pembentukan komponen aroma dan flavour (Athawale et al., 2003), pelumas (Hills, G., 2003), poliester (Kumar, A. Et al., 2000) dan biomodifikasi lemak (Neklyudov, A.D et al., 2002). • Pada industri makanan, lipase dari berbagai sumber telah digunakan sebagai pembentuk aroma dalam proses pembuatan keju dan juga dalam pembentukan aroma pada chocolate crumb, digunakan juga untuk memperbaiki konsistensi dari pengocokan putih telur (Alan, 1975).

5. BIJI KANOLA PENDAHULUAN • Klasifikasi ilmiah Kerajaan: Plantae Divisi: Magnoliophyta Kelas: MagnoliopsidaOrdo: CapparalesFamili: BrassicaceaeGenus: BrassicaSpesies: B. napus

6. Brassica napus L. (suku kubis-kubisan atau Brassicaceae) dikenal dari salah satu kelompoknya yang menjadi tumbuhan penghasil minyak penting dunia. • Minyak kanola juga dikenal dengan nama minyak "LEAR" (singkatan dari Low Erucic Acid Rapeseed). • Minyak yang dihasilkan kultivar masa kini mengandung hingga 65% asam lemak takjenuh sederhana (asam oleat) dan sekitar 30% asam lemak takjenuh berganda (asam linoleat dan asam α-linolenat)  salah satu minyak pangan dengan nilai gizi terbaik. • Penggunaan lain minyak rapa adalah sebagai campuran dalam oli/pelumas, lak, cat, lilin, farmasetika, emulgator, campuran plastik, tensida, dan sabun.

7. TUJUAN Tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari degradasi lipid secara enzimatis pada biji kanola selama perkecambahan.

8. METODE • Bahan yang digunakan • Pengamatan Degradaasi Lipid pada biji Kanola • Uji Aktivitas Lipase dari biji Kanola • Pemurnian Lipase dari biji Kanola • Gel Filtrasi • DEAE Cellulose Chromatography • CM-Cellulose Column Chromatography • Karakterisasi Lipase dari biji Kanola • pH optimum • Suhu Optimum • Spesifitas substrat • Penentuan berat molekul

9. Biji kanola diperoleh dari Bangladesh Agriculture Research Institute, Irshardi, Pabna dan Rajshahi Local Shaheb Bazar Market  dipilih biji yang mature dan baik bentuknya. cawan petri + kertas saring Direndam dengan air destilasi (kontrol) ; larutan NaCl dan buffer Na-Phosphate (Na2HPO4-NaH2PO4)  0, 50, 100, 150, 200 mM Bahan yang digunakan Simpan di ruang gelap T = 25oC, t = 120 jam

10. Interval waktu perkecambahan 24, 48, 72, 96, 120 jam Kotiledon dipisahkan dari biji Dibilas dengan air Disimpan pada T = 4oC

11. Pengamatan waktu perkecambahan dari Brassica napus L. menunjukkan aktivitas maksimum pada 40 jam dan aktivitasnya akan menurun secara drastis pada hari-hari berikutnya  digunakan untuk ekstraksi Lipase.

12. 500 mg biji/280 mg kotiledon Homogenisasi dengan nitrogen cair + 1,2 ml isopropanol  dipanaskan T = 70oC, t = 10 menit Pengamatan Degradaasi Lipid pada biji Kanola Sentrifugasi Bubuk dikeringkan dengan nitrogen Lemak diekstrak dengan campuran chloroform/metanol Penyaringan dengan rotovapor

13. Uji Aktivitas Lipase dari biji Kanola Metode A Substrat  Olive oil 1 unit aktivitas lipase = 1 mol asam lemak bebas yang lepaskan / menit Metode B Hidrolisis Triolein 1 unit Lipase = 1 mmol asam oleat yang dilepaskan per menit pada suhu 37oC

14. Pemurnian Lipase dari Biji Kanola 2 gr kotiledon (40 hari perkecambahan) 25 ml air destilasi Sentrifigasi 8000 g, t = 20 menit , T = 4oC Di bubukan + Amonium sulfat • Supernatan ditampung dalam beaker glass • Percipitate dicampur dengan 25 ml air destilasi Dialisis dengan 5 mM buffer fosfat (pH 7), t = 24 jam Liofilisasi untuk column chromatography

15. Gel Filtrasi Larutkan dalam 10 ml buffer fosfat 50mM pH 7,2 Active protein Kolom Sephadex G-50 DEAE cellulose chromatography Active protein Dialisis dengan 10 mM Tris-HCl (pH 8,2) DEAE cellulose column

16. CM cellulose column chromatography Active protein Larutkan dalam 2 ml air destilasi CM cellulose column chromatography Liofilisasi Dicuci dengan buffer fosfat dan dielusi dengan sodium klorida (0-0,5 mM Aktivitas maksimum

17. Suhu Optimum Aktivitas lipase diamati dalam buffer fosfat dengan variasi pH antara 3-10 pada suhu 37oC pH Optimum Aktivitas lipase diamati dalam buffer fosfat pH 7 dengan suhu bervariasi Spesifitas substrat Dan ion logam Bermacam2 triacylglycerol sebagai substrat dan ion2 logam sebagai aktivator dan inhibitor

18. Penentuan Berat Molekul Gel filtrasi (sephadex column G-75) Marker  Trypsin inhibitor (12.028kD), Carbonic anhydrase (29kD),α-amylase (58kD), bovine albumin (66kD)dan β-galaktosidase (116kD) SDS-PAGE Bio-Rad mini electrophoresis system. PAGE  7% gel, 2000V dan 5A Protein standar lysozyme (14kDa), β-lactoglobulin (18,4kDa), trypsinogen (24kDa), Pepsin (36kDa), chicken albumin (45kDa) dan bovine albumin (66kDa)

19. Penentuan nilai Km Laju sebanding dengan banyaknya produk yang dibentuk per satuan waktu. (Vi) ditentukan dengan menghitung jumlah 1 produk pada waktu yang bervariasi

20. HASIL DAN PEMBAHASAN • Adanya aktivitas lipase yang tinggi, menyebabkan komponen lemak dalam biji kanola menurun secara drastis. • Pengaruh faktor perlakuan dengan adanya buffer • Penurunan pertumbuhan biji oleh adanya pengaruh garam dan Na-buffer disebabkan adanya korelasi inhibisi dari hidrolisis TAG.

21. Pemurnian Lipase :

23. Lipase dari Brassnica napus L. merupakan golongan lipase dengan pH netral • Lipase dari Pen.cyclopium antara 35-40oC dan dari Rh.delemer antara 30-35oC

24. Ba2+ dan Mg2+ menstimulasi kerja lipase pada konsentrasi 1, 2 dan 3 mM • Inhibisi oleh Cu2+,Zn2+, Hg2+ dan Fe2+

25. Apparent Km untuk Brassnica napus L. terhadap substrat olive oil dan triolein adalah 0,23 dan 5,8 mM

26. KESIMPULAN • Lipase dari biji kanola mempunyai aktivitas yang hampir sama dengan lipase-lipase dari tumbuhan. • Dibandingkan dengan lipase dari hewan atau mikroba, mempunyai aktivitas yang lebih rendah. • Lipase dari biji kanola merupakan protein yang kecil dengan mesa molekul 34 kDa, oleh karenanya sangat mudah untuk dilakukan manipulasi yang dapat digunakan sebagai model pembelajaran bagaimana interaksi antara enzim dan substrat dapat terjadi. • Sifat-sifat yang dimiliki lipase seperti pH yang netral, stabilitasnya dan spesifitas substrat dapat diaplikasikan dalam berbagai industri.

27. TERIMA KASIH