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实验九

实验九. ACE 基因多态性分析 ( 血管紧张素转化酶 ) angiotensin converting enzyme, ACE. 实验目的. 掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组 DNA 的方法 掌握 PCR 技术原理 了解基因多态性分析的方法. 原理. 基因组 DNA 抽提 碱裂解法抽提基因组 DNA ACE 基因多态性分析 PCR 方法分析基因多态性. ACE 基因多态性分析. 理论基础

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实验九

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Presentation Transcript

  1. 实验九 ACE基因多态性分析 (血管紧张素转化酶) angiotensin converting enzyme, ACE

  2. 实验目的 • 掌握从微量来源的组织细胞中抽提基因组DNA的方法 • 掌握PCR技术原理 • 了解基因多态性分析的方法

  3. 原理 • 基因组DNA抽提 碱裂解法抽提基因组DNA • ACE基因多态性分析 PCR方法分析基因多态性

  4. ACE基因多态性分析 • 理论基础 ACE基因第16内含子存在一段长度为287bp的插入/缺失（I/D）多态性片段，I/D多态性与血液ACE水平有明确关系，DD型ACE水平最高，ID次之，II最低。左室肥大患者中DD型频率明显增高。 • 实验原理 以DNA为模板，ACE基因特异的引物序列位于287bp插入/缺失片段的两侧进行PCR扩增，故II型扩增片段长度约为490bp，DD型扩增片段长度约为190bp，ID型扩增片段为２个，分别为190bp和490bp。根据PCR扩增片段的大小可进行多态性分析。

  5. 490bp 190bp 插入片段 插入型 缺失型

  6. 操作步骤 • 基因组DNA抽提 • PCR反应 • 琼脂糖凝胶电泳检测

  7. 1. 基因组DNA抽提 • 溶液Ⅰ 10 ml 漱口20秒 收集漱口水； 3000g×5min×RT，弃上清； • 溶液Ⅱ 250 ul 重悬沉淀； 3000g×1min，弃上清；　 • 溶液Ⅲ 250 ul 重悬沉淀，振荡10秒； 转至0.5 ml离心管， 99℃×5min； • 溶液IV 50 ul 振荡5秒； 3000g×1min， • 上清转移至新0.5 ml离心管，取5 ul用于PCR.

  8. 2. PCR反应 • 取消毒的0.5 ml离心管，加入下列成分： 10×PCR Buffer 2.5 μl dNTP(2.5 mM each) 2 μl DNA模板 5 μl 引物混合物(10μM each) 2 μl ddH2O 13 μl Taq DNA polymerase 0.5 μl 总体系 25 μl • 混匀，加石蜡油2滴。 • 扩增程序为：94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸40sec，共反应35个循环。

  9. 琼脂糖电泳检测 • 制备1％琼脂糖凝 • 点样，电泳 • 紫外灯下观察结果

  10. ACE基因多态性电泳图

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