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酵母双杂交系统

酵母双杂交系统. Yeast Two Hybrid System (Interaction trap). 学生：吴翌鎏 导师：文铁桥. 用途：研究活体内蛋白质相互作用 原理：. GAL4 ：转录激活因子，含 DNA 结合功能域 (DNA binding domain ， DNA-BD) 和转录激活结构域 (activation domain ， DNA-AD). UAS ： upstream activating sequence ，是 DNA-BD 的结合区域. 只有当被分开的 BD 、 AD 在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的 GAL4

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酵母双杂交系统

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Presentation Transcript

  1. 酵母双杂交系统 Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 学生：吴翌鎏 导师：文铁桥

  2. 用途：研究活体内蛋白质相互作用 • 原理： GAL4 ：转录激活因子，含DNA结合功能域 (DNA binding domain，DNA-BD)和转录激活结构域(activation domain，DNA-AD) UAS： upstream activating sequence，是DNA-BD的结合区域 只有当被分开的BD、AD在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4 转录因子活性，启动基因表达

  3. 需要条件 • BD-plasmid， AD-plasmid，内源性Gal4失活，选择标记 P: ADH1启动子 T: ADH1终止子 ADH：Alcohol dehydrogenase 筛选标志：TRP 核定位信号是GAL4本身的一部分 BD-plasmid

  4. P: ADHI启动子 T: ADHI终止子 筛选标志：LEU2 核定位信号是SV40的T抗原的序列 AD-plasmid

  5. 需要条件 • 报告基因：HIS（合成组氨酸） • 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c）

  6. 筛选存活选择 在缺少亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）培养基上筛选双载体转化子。 Trp- Leu- 双载体转化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌体存活。

  7. 筛选蛋白相互作用的选择 在缺少组氨酸（HIS）、亮氨酸（LEU）和色氨酸（TRP）的培养基上筛选能相互作用菌落 His- Trp- Leu-

  8. 酵母双杂交实例——我们的研究

  9. 酵母双杂交技术路线 克隆基因 全长cDNA 构建诱饵质粒 小鼠脑cDNA文库质粒的扩增，纯化 自激活检测 诱饵质粒和cDNA文库质粒共转化酵母AH109 利用LEU、TRP、HIS、ADE等营养缺陷报告基因和LacZ报告基因筛选阳性克隆 阳性克隆测序，同源性分析

  10. 1 2 3 1 2 3 诱饵载体自激活的β-半乳糖苷酶检测图 （1:转化了pGBKT7-基因X质粒的酵母AH109，2：转化了阴性对照质粒的酵母AH109，3:转化了阳性对照质粒的酵母AH109） pGBKT7表达载体EcoRI 和SalI双酶切电泳图 (1-未插入片段的pGBKT7表达载体；2-插入片段的pGBKT7表达载体；3-DCF1片段) 诱饵载体的构建和自激活 1.AH109 (pGBKT7-基因X)在SD/-Trp/-His培养基上不能生长表明单一的质粒pGBKT7-基因X没有激活报告基因HIS3的表达。 2.β-半乳糖苷酶活性滤膜影印分析法检测 ，AH109(pGBKT7-基因X)在8h内菌落不变蓝，即不能自激活LacZ的表达。 诱饵载体无自激活效应，可用于后续实验

  11. cDNA文库筛选的β-半乳糖苷酶检测图 小鼠脑cDNA文库 的筛选 1.扩增、纯化小鼠脑cDNA文库的质粒DNA，与pGBKT7-基因X 质粒共转化酵母AH109， 在SD/-Trp-Leu-His-Ade平板，得到105个单克隆。 2.检测了这105个单克隆β-半乳糖苷酶基因的表达，共有20个克隆呈蓝色(即表达β-半乳糖苷酶基因)

  12. 阳性克隆的鉴定 1.从上述得到的20个阳性克隆提取质粒，测序 2.在NCBI进行blast,将有意义的文库质粒与诱饵质粒再次转化酵母AH109，只有带有ATPase, Na+/K+ transporting, beta 1 polypeptide （ATP1B1）序列的文库质粒仍能在SD/-Trp-Leu-His-Ade上生长，且能表达LacZ基因。 初步鉴定ATP1B1能与基因X相互作用

  13. 荧光共定位流程图 克隆基因X全长cDNA 克隆ATP1B1全长cDNA 构建成能表达基因X-EGFP融合了绿色荧光蛋白的载体 构建成能表达ATP1B1-DSRED2融合了红色荧光蛋白的载体 共转染神经干细胞C17.2 在激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白在细胞内的共定位

  14. 1 2 3 HindIII和ApaI双酶切pDSRED2载体图 （1:marker 2:pDSRED2-ATP1B1重组质粒 3: pDSRED2-C1空质粒） 荧光共定位验证蛋白相互作用 证明基因X和ATP1B1在神经细胞内存在相互作用的基础

  15. 克隆基因X全长cDNA 克隆ATP1B1全长cDNA 构建成能表达基因X-HA融合蛋白的载体 构建成能表达ATP1B1-Myc融合蛋白的载体 共转染神经干细胞C17.2 抽提细胞蛋白，进行免疫共沉淀 免疫共沉淀流程图

  16. IP: anti-HA WB: anti-MYC 1 2 3 4 ATP1B1 anti-HA对细胞裂解上清液进行免疫共沉淀图 （1. pCMV-HA-基因X和pCMV-MYC-ATP1B1共转染细胞组的免疫共沉淀样品2.未转染任何质粒的C17.2细胞裂解上清液 3.C17.2细胞表达ATP1B1蛋白的细胞裂解上清液，作为阳性对照 4. pCMV-HA和pCMV-MYC-ATP1B1共转染细胞组的免疫共沉淀样品，作为阴性对照） 1 2 3 4 5 EcoRI和BglII双酶切pCMV-HA和pCMV-MYC载体图 （1. pCMV-HA-基因X重组质粒 2.pCMV-HA空质粒 3.pCMV-MYC-ATP1B1重组质粒 4. pCMV-MYC空质粒5:marker） 免疫共沉淀验证蛋白相互作用 进一步证明了基因X和ATP1B1在神经细胞内的相互作用

  17. 基因X ATP1B1 BACE1 RNAi沉默基因X检测ATP1B1及AD相关基因的表达 • β-淀粉样蛋白（β-amy-loid protein，aβ）在ad的发生、发展中起着重要作用。BACE1（β-site app cleaving enzyme），即β-分泌酶，是淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，app）产生aβ的关键酶。 1. ATP1B1是ATPase的一个组成部分，具有组织特异性，能调控alpha亚基，且有文献表明它与AD(阿兹海默病）相关基因BACE1有相互作用 2.于是我们沉默基因X基因的表达，来研究基因X；ATP1B1；BACE1三者的关系。

  18. 1. psiRNA-基因X:能转录出带有发夹结构的RNA，特异性沉默基因X psiRNA-基因X-CK:含有无关序列，作为阴性对照、 psiRNA:空载体 分别转染c17.2细胞 2. 转染72小时后，做Realtime PCR，分别检测beta actin,基因X,ATP1B1,BACE1 这4种基因的表达, 以beta actin作为基准，用ΔΔct法计算，psiRNA-基因X沉默组，psiRNA-基因X-CK打乱序列组相对于psiRNA空载体组的基因表达量

  19. psiRNA-基因X组，psiRNA-基因X-CK组相对于psiRNA组的基因表达量图 随着基因X的下调，ATP1B1和BACE1也出现了大幅下调

  20. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 MluI和BglII双酶切pGL3-BASIC质粒 （4: P(-577/+2)重组质粒 5: P(-659/+2)重组质粒 9: P(-804/+2)重组质粒 12：P(-933/+2)重组质粒 14：P(-1058/+9)重组质粒 15：Marker 其余泳道为pGL3-BASIC空质粒） 利用荧光素酶系统研究DCF1启动子 将多个不同长度的DCF1启动子片段(约577,659,804,933,1058bp)构建到荧光素酶报告载体pGL3中，分别检测它们的荧光素酶活性，初步检测出DCF1基因5’侧翼序列中具有启动子功能的片段及预测相应片段中决定转录调控效率的转录因子

  21. P(-1058/+9) Luc P(-933/+2) Luc P(-804/+2) Luc Luc P(-659/+2) P(-577/+2) Luc pGL3basic Luc -1058 -933 -804 -659 -577 +9

  22. 结论总结 1：利用酵母双杂交技术，以DCF1为诱饵蛋白，在小鼠脑cDNA文库成功筛选到了与DCF1相互作用的蛋白，ATP1B1，并用荧光共定位和免疫共沉淀进一步证实了它们的相互作用 2：利用RNAi技术，沉默DCF1，研究ATP1B1和AD相关基因BACE1的表达变化，结果显示DCF1被抑制后ATP1B1和BACE1的表达也出现了大幅下调 3：将多个DCF1 5’侧翼序列的缺失体构建到荧光素酶报告基因pGL3中，分别检测它们的荧光素酶活性，初步检测出DCF1基因5’侧翼序列中具有启动子功能的片段及预测了相应片段中决定转录调控效率的转录因子。

  23. 讨论与展望 • 随着DCF1的下调，ATP1B1与BACE1的表达也出现了大幅的下调。揭示了DCF1与ATP1B1和BACE1还存在着反馈抑制或调控的关系，然而这只是mRNA层面上的变化。蛋白层面上的变化还有待于进一步的研究。 • 阐明DCF1与BACE1的关系，有助于了解DCF1在神经系统中的功能和AD发生发展的分子机制，并有可能使DCF1成为AD治疗的新的药物作用靶点 • DCF1启动子的分析揭示了DCF1的转录调控机制是复杂的，它的表达受到多种转录因子的调节，若能进一步明确是哪个转录因子在何时作用于DCF1启动子，对于回答DCF1的时空特异性表达现象具有非常重要的意义

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