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第五章 酶分子的化学修饰 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计 酶化学修饰的应用

第五章 酶分子的化学修饰 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计 酶化学修饰的应用. 第一节 酶的活性中心（ active site ） 一、活性中心的概念 酶的必需基团 (essential group): 与酶活性有关的基团 酶的活性中心 (active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域. 非必需基团. 酶分子. 非活性中心. 活性中心外 必需基团. 必需基团. 结合基团. 活性中心. 活性中心 必需基团. 催化基团. 活性中心的重要化学基团 7 种氨基酸出现的频率最高

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第五章 酶分子的化学修饰 酶的活性中心 酶化学修饰的目的 酶化学修饰的原理 酶化学修饰的设计 酶化学修饰的应用

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  1. 第五章 酶分子的化学修饰 • 酶的活性中心 • 酶化学修饰的目的 • 酶化学修饰的原理 • 酶化学修饰的设计 • 酶化学修饰的应用

  2. 第一节 酶的活性中心（active site） • 一、活性中心的概念 • 酶的必需基团(essential group): 与酶活性有关的基团 • 酶的活性中心(active center): 由必需基团构成的与酶催化活性有关的特定区域.

  3. 非必需基团 酶分子 非活性中心 活性中心外 必需基团 必需基团 结合基团 活性中心 活性中心 必需基团 催化基团

  4. 活性中心的重要化学基团 7种氨基酸出现的频率最高 Lys Asp Glu Cys His Tyr Ser （兰天果拌猪肉丝） 某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基 和咪唑基）是酶的必需基团。 赖氨酸的氨基 天冬氨酸和谷氨酸的羧基 半胱氨酸的巯基 组氨酸的咪唑基 酪氨酸和丝氨酸的羟基

  5. 影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物 维持酶活性中心应有空间构象所必需的基团 与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物

  6. 二、活性中心的共性 (1)活性部位只占酶分子很小的一部分（1-2%）。 (2)活性部位是一个三维实体。 (3)活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。 (4)活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。 (5)酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。

  7. Active site The active site is the region of the enzyme that binds the substrate, to form an enzyme-substrate complex, and transforms it into product. The active site is a three-dimensional entity, often a cleftor crevice on the surface of the protein, in which the substrate is bound by multiple weak interactions.

  8. 三、研究酶活性中心的方法 1.物理学方法： 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。

  9. 2.化学修饰法：根据所用修饰试剂不同，分为 1)非专一性化学修饰 用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团作用。 若某基团被修饰后： 酶活性不变——该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失——该基团可能是酶的必需基团 但不能确定化学试剂是同活性中心内的必需基团结合。

  10. 活性中心基团的鉴定标准 ①失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。 ②S或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。 先加S或竞Ⅰ 加共价修饰剂 透析除去S或竞Ⅰ 活性不丧失

  11. 差别标记： 底物或抑制剂存在 活性基团不与修饰剂作用 去除底物或抑制剂 原来被保护的基团带同位素标记 可直接得到蛋白质发挥功能作用的必需基团。 化学修饰 含同位素标记 的同样试剂

  12. 2)专一性化学修饰（基团专一性修饰） 用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。 3)亲和标记（位点专一性修饰） 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。 作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。

  13. 化学修饰的专一性

  14. Y Y Y Y X Y X-Y

  15. 亲和修饰剂： ①与S结构相似，与活性中心的氨基酸残基 亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸 残基亲和力小。 ②具有活泼的化学基团（如卤素）可与活性 中心的基团形成稳定的共价键。

  16. 3.蛋白质工程： 将酶相应的cDNA定点突变，突变的cDNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。

  17. 第二节 酶化学修饰及修饰目的 一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)酶活性不够高； 3)具有抗原性。

  18. 2. 改变酶特性有两种主要的方法： 1)通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。 2)通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。

  19. 3. 酶化学修饰的概念 • 酶的化学修饰（chemical modification）： • 通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变。 • 酶选择性化学修饰： • 描述肽链侧链基团被化学试剂专一性地修饰。

  20. 二、酶化学修饰的目的 1. 研究酶的结构与功能的关系。（50年代末） 2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用 范围。（70年代末之后） 1）提高酶的生物活性（酶活力）。 2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。 3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。 4）产生新的催化能力。

  21. 第三节 酶化学修饰的原理 一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。 二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。

  22. 三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶 酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶： 1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。 2. 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。

  23. 四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境 1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。 破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。

  24. 第四节 酶化学修饰的设计 一、充分认识酶分子的特性 包括酶的—— 1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件 3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性

  25. 二、 修饰剂的选择 要考虑—— 1.修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量） 2.修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团） 3.修饰剂上反应基团的活化方法与条件

  26. 三、反应条件的选择 要注意—— 1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件 3. 反应温度及时间

  27. 第五节 酶化学修饰的种类及应用 一、酶的表面化学修饰 （一）大分子修饰（大分子结合修饰） 是目前应用最广的酶分子修饰方法。 1.定义：利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。

  28. 2. 修饰剂： 聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。 修饰方法：修饰前活化，然后在一定条件下与酶分子共价结合。

  29. 3. 应用： • 如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD） • PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等） • PEG－天门冬酰胺酶（ASNase） • 消除了抗原性 • 延长了酶在体内的半衰期 • 又如：用Dextran修饰-淀粉酶，－淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。

  30. （二）小分子修饰 （酶蛋白侧链基团修饰） • 定义：通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。 • 侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。 • 侧链基团修饰剂：采用的各种小分子化合物。 • 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。

  31. 根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。根据氨基酸侧链R基的极性，20种氨基酸可分成4类。 1. 非极性R基氨基酸（共8种）： 丙氨酸(Alanine,Ala,A), 亮氨酸(Leucine,Leu, L), 缬氨酸(Valine,Val,V)), 异亮氨酸(Isoleucine,Ile,I), 苯丙氨酸(Phenylalanine,Phe,F), 色氨酸(Tryptophan,Trp,W), 甲硫氨酸(Methionine,Met,M), 脯氨酸(Proline,Pro,P)

  32. 2.无电荷的极性R基氨基酸（共7种）： 丝氨酸(Serine,Ser,S), 苏氨酸(Threonine,Thr,T), 酪氨酸(Tyrosine,Tyr,Y), 半胱氨酸(Cysteine,Cys,C), 天冬酰胺(Asparagine,Asn,N),甘氨酸(Glycine,Gly,G), 谷氨酰胺(Glutamine,Gln,Q) 3.带正电荷的极性R基氨基酸（共3种）： 赖氨酸(Lysine,Lys,K), 精氨酸(Arginine,Arg,R), 组氨酸(Histidine,His,H) 4.带负电荷的极性R基氨基酸（共2种）： 天冬氨酸(Aspartic acid,Asp,D), 谷氨酸(Glutamic acid,Glu,E)

  33. 几种重要的修饰反应： • 烷基化反应 • 酰化反应 • 氧化还原反应 • 芳香环取代反应

  34. 1. 化学修饰反应的类型 1) 烷基化反应 • 试剂特点：烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如－NH2，-SH等）发生烷基化。 • 可作用基团： • 氨基（Lys，Arg），巯基（Cys），羧基（Asp、Glu），甲硫基（Met），咪唑基（His）。 • 修饰剂：2，4－二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。

  35. 烷基化反应

  36. 2) 酰基化反应 • 试剂特点： • 含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。 • 可作用基团： 氨基，巯基，醇羟基（Ser、Thr），酚羟基（Tyr）

  37. 酰基化反应

  38. 3) 氧化和还原反应 • 试剂特点：具有氧化性或还原性。 • 氧化剂：H2O2 ，N-溴代琥珀酰亚胺 • 可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（Trp）、咪唑基，酚基等。 • 还原剂：2－巯基乙醇、DTT等。 • 可被还原的侧链基团：二硫键。

  39. 连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。

  40. 4) 芳香环取代反应 • 试剂：卤（碘）化，硝化试剂。 • 碘代： • I2＋ + HI • 硝化： • (NO2)4C +  +(NO2)3CH （四硝基甲烷）

  41. 2.特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰 1) 氨基的化学修饰： 来源：Lys, Arg, His, Gln 修饰反应：酰基化与烷基化 酰基化修饰剂: 三硝基苯磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS） 烷基化修饰剂： 2，4－二硝基氟苯（DNFB）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等

  42. 2) 羧基的化学修饰 • 修饰羧基的反应专一性较差。 • 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。 • +  • 水溶性碳化二亚胺

  43. 3)胍基的化学修饰 来源：Arg 修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。 修饰剂： 丁二酮 二羰基化合物 1，2－环己二酮 苯乙二醛

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