BIOPROCESSING

1. BIOPROCESSING „BIO-FELDOLGOZÁS”

2. Downstream processing: a kívánt termék tisztítása, kiszerelése Nyersanyag Nyersanyag előkészítés Fermentáció, biotranszformáció termék kinyerés, kiszerelés Termék Ipari biotechnológia kulcslépései • Upstream processing: a nyersanyag előkészítése a fermentációra, vagy transzformációra • Fermentáció,transzformá-ció: bioreaktorokban sejtszaporítás, antibiotikum, fehérje, stb. előállítás

3. 1. Upstream - bioreaktorok - tápanyagok - sterilizálás - oxigénellátás - aerob/anaerob fermentálás 2. Downstream - sejt izolálás - feltárás - extrakció - fehérje tisztítás - kiszerelés - melléktermékek, hulladék kezelés

4. Fermentáció • A gyógyszer-, élelmiszer-, és vegyiparban használt (bio-) termékek előállításában a mikrobiális fermentációknak nagy jelentőségük van • Fermentáció hatékonysága sajnos gyakran elmarad a teoretikus maximumtól • Mikroba fiziológia • Rekombináns sejtekkel történő fermentációk • Mikrobiális konverziók – fermentáció • Enzimatikus folyamatokon alapuló konverzió – biokonverzió • Fermentor– reaktor, melyet mikrobiális konverziókra haszn.

5. Fermentációs eljárások típusai Nyílt és zárt rendszerek • Szakaszos fermentáció (Batch) • a reaktánsokat (tápanyagok, sejtinokulum, gázok – folyamatos levegőztetés) együtt visszük a rdsz-be a fermentáció megkezdése előtt • alapvetően zárt rdsz • térfogat állandó • Egyszerű eljárás, de termékgátlás ill. szubsztrát gátlás lehetséges • Rátáplálásos szakaszos fermentáció (Fed-batch) • a tápanyagokat folyamatosan adagoljuk(szubsztrát gátlás elkerülése) • a térfogat nő, mert nincs elvezetés • Folytonos fermentáció (continuous) • nyitott rdsz • amennyi tápanyagot bejuttatunk, annyi térfogatnyit el is veszünk • paraméterek állandóak • Félfolytonos fermentáció (semicontinuous) • szakaszos fermentációk sorozata, melyben a fermentlé kb 10%-át a fermentorban hagyjuk, és ehhez adjuk a friss tápanyagokat

6. bioreaktorok • Központi szerep, a bioreakciók helyszíne • Fontos a sejt kinetika, anyagtranszfer, folyadék keveredés a bioreaktor tervezéshez • Bioreaktor – hardware és software szabályozás, a mikroorg. számára fontos környezeti faktorok szinten tarthatók • Kultúra paraméterei: hőmérséklet, keverési sebesség, nyomás, gázáram, pH, pO2, esetleg pCO2, hígulás mértéke • Nagy felbontású (elsősorban laboratóriumi, az optimalizáláshoz) bioreaktorokba lehet on-line optikai denzitás mérés, szubsztrát konc. meghat.

8. Bioreaktor konfigurációk • A bioreaktor (fermentor) egy edény, melyben a biológiai reakciókat kivitelezzük: • mikroorganizmus szaporítása, enzim- vagy immobilizált sejtes reakciók, szövettenyészetek • méret: 0,5-2 000 000 l • üveg-rozsdamentes acél, esetleg műanyag • Alapvető paraméterek nyomon-követhetők • Mintavételezési lehetőség • Kevertetés -nyíróerők

9. Bioreaktor konfigurációk • Görgetett edény • Ált. műanyagból • Horizontális kialakítású, lassú keveréssel • Megfelelő levegőztetés, anyageloszlás érhető el • A sejtek a henger belső felszínéhez tapadva szaporodnak, nem lepi el folyamatosan a tápoldat • A töltet a henger térf. max 30%-a lehet • Olcsó, de a kontroll, és monitor nem hatékony Szabályozó egység Bioreaktor edény Görgető rendszer

10. Bioreaktor konfigurációk • Kevertetett tank bioreaktorok • Leggyakrabban használt típus • Mechanikus keverő rdsz-rel ellátott • Rozsdamentes acél (kisebb térf-nál lehet üveg) • Magasság:átmérő arány (1:1, 3:1) • Keverés keverőlapátokkal, azok kialakítása a nyíróerők szempont-jából fontos • Levegőztetés megoldása • Sejtek denzitása ált. 106-107 sejt/ml, de ez javítható akár több nagyságrenddel is • Mérete akármeddig nem növelhető a keverés, oxigénellátás, hőmérséklet tartás miatt Kevert tankreaktor (angol: stirred tank bioreactor ‘STB’)

11. távozógáz Gáz buborék Belső cső elem a gáz áramlás biztosítására áramlásmérő Gáz elosztó Gáz beinjektálása Bioreaktor konfigurációk • Air-lift bioreaktorok • Egyszerű, olcsó • A reaktor belsejében egy központi cső, un. emelő (riser), és egy külső hengeres gyűrű un. levezetőcső (downcomer) • Fertőzés veszély is csökken • Sejtek denzitása ált. 106 sejt/ml

12. Bioreaktor konfigurációk • Fluid-ágyas bioreaktor • Hordozó, sejtaggretátok, kisebb térfogat (max 100 L) • nagy sejtmennyiséggel – szuszpendált és kitapadó sejtek is • Transzport folyamatok - nem elég hatékony • Fejlesztés kollagén mikrohordozóval jó eredmények • Reciklizáló cső • Sejtek denzitásaált. 108 sejt/ml

13. Bioreaktor konfigurációk • Üreges szálas-bioreaktorok • Egyszerű, de max néhány liter • Kapilláris szálak egy henger testben, mindkét végén tapadnak • A sejtek a kapillárisok közötti térben szaporodnak (szövetszerű) • Főleg humán sejtkultúrák számára • Sejtek denzitása 108 sejt/ml • Termék visz. tisztán nyerhető

14. Bioreaktor konfigurációk • Fix ágyas bioreaktorok • A sejtek hordozóhoz (pl. aktív szén) kötötten, vagy polimerbe csomagoltan • Fluid ágyassal szemben előny a stabilitás • Hátránya, hogy a transzport folyamatok mértéke kisebb, grádiens alakulhat ki a bioreaktorban(nem lesz homogén a rdsz) • Sejtek denzitása ált. 106-107 sejt/ml • Termék kinyerése nehézkesebb • Kerámia ágyas bioreaktorok • Kerámia hordozó, újrahasználható, költséghatékony • Jó minőség, hőmérséklet tolerancia • Széles körű felhasználás • Inhomogenitás lehet a reaktorban • Sejtek denzitása ált. 107-108 sejt/ml

15. termék hőcserélő bioreaktor keverés • Mechanikus propellerek segítségével • Levegő áramoltatás segítségével • Külső hurok/ forgatás segítségével

16. keverés • Feladata a megfelelő anyagtranszport fenntartása, azaz a beáramló levegő, a tápoldatban oldott (vagy nem oldott) tápanyagok, és a keletkező termékek egyenletes eloszlatása • Az egyes oldatok viszkozitása szintén befolyásolja a keverés módját, mértékét. Ez az időben változhat, egyrészt a szaporodó mikróbák, valamint a keletkező termék miatt. • A kevertetés mértéke akármeddig nem növelhető a nyíróerők miatt • A keverés sebességét és a levegőztetés sebességét egymást figyelembe véve kell optimalizálni (ne alakuljanak ki légüregek)

17. Propeller fajták

18. levegőztetés • Eltérő oxigénigény • aerob/anaerob szaporítás • baktériumok/gombák • enzimes/sejtes folyamatok • Oldott oxigén szint • oldhatóság mértéke hőmérséklet függő • Buborék méret • túl nagy buborék – hiábajuttatunk sok levegőt be, nem hasznosul • intenzív keveréssel lehet apró buborékokat nyerni • eleve apró buborékképzés - pezsegtetés külső belső

19. oxigénellátás

20. tápközeg Szilárd v. folyékony Természetes, félszintetikus, szintetikus Tápanyagok: • Szén-, energiaforrás • Nitrogénforrás, egyéb ásványi anyagok • Mikroelemek • Vitaminok • Növekedési faktorok

21. Szén-, és energiaforrások Természetes: • melasz: a cukorgyártás mellékterméke. ~ 50% cukortartalom, de emellett jelentős nitrogénforrás is • sajt/tej permeátum: 6-7% szárazanyagtartalom, főleg laktóz, kevés zsír, fehérje, ásványianyagok • Magáztató folyadék (corn steep liquor-CSL): a magok nedves őrlése során keletkezik, cukrok és kismolekulasúlyú N tartalmú vegyületek • Manióka v. cassava: 20-40% keményítő, kevés fehérje, zsír • Bagasse: cukornádból a cukor kinyerése után visszamaradó rostos anyag

22. Szén-, és energiaforrások Drágább, de természetes alapú alapanyagok: • húskivonat: fehérjéket, aminosavakat tartalmaz. Húsleves bepárlásával állítják elő. Lekvárszerű illetve por alakú • pepton: fehérjék savas vagy enzimatikus hidrolízisével állítják elő. Vízbenkönnyen oldódik. A fehérjék tripszines lebontásával (mely egészen azaminosavakig megy) keletkező magas triptofán tartalmú pepton a Trypton • Élesztőkivonat Pontos összetételük nem mindig ismert, változhat, ezért pl. laborban a kísérletek kivitelezése során inkább jól definiált alapanyagokat használunk

23. Nitrogén források • Szervetlen: • nitrát sók, ammónium sók • Szerves • Kukoricalekvár: a kukoricaszem áztatása során keletkező áztatólé 50%-ra töményítve • Húskivonat • Pepton, tripton

24. egyebek • Szervetlen ionok: • Foszfor, kén, vas, nyomelemek • Növekedési faktorok: • melyekre a mikróbáknak szükségük van szaporodásukhoz, de szintetizálni nem tudják • Szelektív ágensek: • Specifikusak az adott mikrobára, másokra gátló hatásúak • Habzás gátlók • csökkentik a felületi feszültséget (a folyadék-gáz határfelületen), ennek következtében a légbuborékok átmérője kisebb lesz • Szelektív körülmények • Pl. szén-, nitrogén forrás limitáció- elősegítheti bizonyos anyagok intenzívebb termelődését, extracelluláris termékek képzése • Van elég szénforrás, de kevés a nitrogén forrás poliszaharid, PHA felhalmozás (akkumuláció) lehet

25. sterilezés (csíramentesítés) • Szennyező mikroorganizmusok elpusztítása a fermentáció előtt • Hőkezelés, sugárzás (UV, gamma), kémiai ágensek, ultrahang, szűrés • Hőkezelés gőzzel, ha nyomást is tudunk alkalmazni, jobb a hatékonyság, rövidebb idő elég (teszt organizmus Bacillus stearothermophilus) • Spórák elpusztítása érdekében néha többszörös sterilezés szükséges, ez azonban károsíthatja a tápanyagokat (pl. cukrok karamellizálódnak)

26. sterilezés (csíramentesítés) • Tápoldat + gáz sterilezés • Folyadék • - szűrés/ülepítés • - kémiai-, hő- inaktiválás • 1. Szűréssel: • - cellulóz alapú filterek, pórus átmérő igény szerint változó 0,2 - 0,45 mm • 2. Inaktiválással: • - hőkezelés: teszt mikróba: Bacillus stearothermophilus • hőérzékenytápkomponensek • 3. Kémiai: hypo, formaldehid oxidálószerek (pl. H2O2, peroxiecetsav)

27. sterilezés (csíramentesítés) Gáz - szűrés - UV, röntgen - kémiai Mi szennyez?: • penészgombák >> egyebek • fágok kiszűrése még ma sem megoldott Szűrés • filterek –hidrofób jelleg • formaldehiddel átitatott üveggyapot • kritikus sebesség/perc hatásfok igény: 0,5 - 1,5 térf. levegő/perc folyadék térfogatonként

28. Fermentációs termékek • Sejt pl. élesztő, SCP • Elsődleges metabolitok pl. citromsav, etanol, glutaminsav (ált. 200 000 L kevertetett tank fermentorokban) • Másodlagos metabolitok pl. antibiotikumok (ált. 50 000 – 200 000 L térfogatban) • Enzimek (főleg extracelluláris, pl. amilázok, proteázok, lipázok. 30-220 m3 térf) • Terápiás fehérjék pl. interferon, növekedési hormon, inzulin… • Vakcinák pl. hepatitis-, szamárköhögés ellen

29. termékkinyerés Centrifugálás, ülepítés, szűrés - sejtek összegyűjtése • Ha sejtalkotót, vagy intracelluláris terméket áll. elő szükséges a sejtek feltárása: • mechanikai: örlő malom, ultrahang, nyomás • kémiai: szerves oldószerek, detergensek • enzimatikus: lizozim (G+ baktériumokra, G- esetén SDS-sel együtt) • Extrakció, filtráció, adszorbció, kicsapás • Kis molekulák kinyerése pl. folyadék-folyadék extrakció • Oldószeres –hidrofób termék esetén • Detergens segítségével • Filtráció – szűrőn áteresztjük, dializis • Adszorbció - hordozóhoz kötjük a kinyerni kívánt anyagot • Kicsapás – csapadékot képzünk pl. magas sókonc-val (pl. ammónium-szulfátos) • Tisztítás • Kromatográfia (álló- és mozgó fázis) • Gélfiltráció • Elúciós kromatográfia (ioncserés, hidrofób, affinitás)

30. Sejtek összegyűjtése, koncentrálása centrifugálással

31. Sejtek feltárása ultrahang (1), detergens (2), nyomás (3), örlő malom (4) segítségével

32. Kromatográfiás folyamatok • Kromatográfia elválasztási módszer. • Kromatográfiában az állófázis(mely ált. porózus, nagy felülettel rendelk. anyag) és a mozgófázis (ált. folyadék vagy gáz) között megoszlanak az anyagok egyensúlyi állandójuk szerint. • A mozgófázis magával ragadja a vizsgálandó anyagot, amely így a befecskendezési ponttól a detektorig (érzékelő berendezés) jut. • Az állófázissal erősebb kölcsönhatással rendelkező anyagok később távoznak, mint a gyengébb kölcsönhatással rendelkezők. • Az anyagok vándorlásuk során egyre szélesebb tartományt foglalnak el.

33. Kromatográfia - gélfiltráció • Molekula méret szerinti elválasztás • Töltet: porózus szemcsék • Természetes polimerek (pl. dextrán, agaróz) • Szintetikus polimerek (pl. poliakrilamid)

34. Kromatográfia - Hidrofób kromatográfia • Magas sókoncentráció mellett fehérjék képesek/hajlamosak poláros felszínhez kötődni • A sókonc. csökkentésével a fehérjék leválnak a hordozóról, eltérő sókonc-nál hidrofób tulajdonságuknak megfelelően

35. Kromatográfia - Affinitás kromatográfia • Gélágy ligandja specifikus affinitással bír az elválasztandó anyaghoz • Az adszorbeált termék leválasztása pl. sókoncentráció, pH változtatás, vagy akár a ligandot az eluáló szerhez adjuk

36. Kromatográfia - Ioncserés kromatográfia • Erős kationcserélő oszlop:a negatív töltésű állófázison pozitív ionokat választunk el. • Erős anioncserélő oszlop: pozitív töltésű állófázison negatív ionokat választunk el. • Ioncserélő kapacitás függ az állófázison kötött töltések számától. • A termék leválasztására ellenionokat tart-ó eluenst haszn.

37. kiszerelés • Kristályosítás • A kristály - csak egyféle anyag alkothatja a kristályrácsot • Szárítás • ált. nagy felületen forró levegővel • Liofilizálás • hőérzékeny termékekre: vitaminok, enzimek, vakcinák, mikróbák, gyógyhatású fehérjék • Csomagolás • Hulladékkezelés