Nekodējošās RNS

1. Nekodējošās RNS Vai: ir vairāk nekā 3 RNS veidi...

2. Cik liela daļa no transkribētajām cilvēka RNS kodē proteīnus? • Augstākajos eikariotos, 98% transkribēto RNS sekvenču netiek translētas • No šiem 98%, aptuveni 50-70% ir introni • Pārējās transkribējas no RNS gēniem, t.sk. rRNS, tRNS un liela skaita citu nekodējošo RNS («non-coding» , ncRNS) • Pat introni mēdz saturēt ncRNS, piemēram snoRNS un miRNS • Zīdītāju genoms varētu saturēt aptuveni 100000 dažādu ncRNS

3. Divi galvenie ncRNS veidi • Mājturības («housekeeping») ncRNS, kuras tiek konstitutīvi ekspresētas un pilda normālas organisma funkcijas • Regulējošās ncRNS tiek ekspresētas noteiktās organisma attīstības stadijās vai kā atbilde uz ārējiem faktoriem. Šīs RNS var ietekmēt citu gēnu ekpresiju transkripcijas vai translācijas līmenī

4. Mājturības ncRNS • tRNS un rRNS - translācija • snRNA («small nuclear») – Pre-mRNS splaisings • snoRNA («small nucleoluar») – rRNS modificēšana • gRNS («guide») – dažiem protistiem - RNS editēšanā • Telomerāzes RNS – praimeris telomēru DNS sintēzē • Vēl dažas...

5. RNS editēšana • mRNS sekvences enzimātiska izmainīšana • Bieži sastopama vienšūņu mitohondrijos, kur editēšanas procesu – uridīnu deletēšanu/insertēšanu vada īpašas gRNS • RNS editēšana ir daudz retāk sastopama zīdītājiem, turklāt bez gRNS palīdzības un bez insercijām/delēcijām • Zīdītājiem RNS editēšana notiek ar īpašu enzīmu palīdzību, kuri atpazīst noteiktas mRNS sekvences un deaminē A vai C bāzes • Piemērs: ApoB proteīna mRNS editēšana, deaminējot C par U (bez gRNA palīzības)

6. gRNS loma editēšanā vienšūņos

7. Editosoma gRNS • Vienšūņos RNS editēšanu veic multiproteīnu-gRNS-mRNS komplekss- editosoma • Editosomas sastāvā ir endonukleāzes, terminālās uridīna transferāzes, uridīna eksonukleāzes, ligāzes un citi proteīni Enkurrajons mRNS Editosoma

8. 4.5S RNS un 7S RNS – daļa no signāla atpazīšnas daļiņas (Signal Recognition Particle, SRP) • SRP atpazīst augošas polipeptīdu ķēdes signālsekvenci • Pēc signāla atpazīšanas, ribosoma piesistās endoplazmatiskajam tīklam, tādejādi sintezējamais proteīns nokļūst sekrēcijas ceļā

9. SRP struktūra RNS satur kopā kompleksa subvienības, kā arī palīdz piesaistīties pie ribosomām

10. tmRNS un trans-translācija • tmRNS ir baktērijās sastopama hibrīda molekula, sastāv no tRNS daļas un mRNS daļas • tmRNS palīdz atbrīvot ribosomas, piesaistītas pie mRNS bez terminācijas kodona • Papildus tam, tmRNS proteīnam pievieno degradācijas signālu

11. 3’ • Ja kaut kāda iemesla dēļ mRNS nesatur terminācijas kodonu, sasniedzot mRNS 3’ galu, ribosoma «iestrēgst» • Tā kā terminācijas kodons netika sasniegts, visticamāk, arī sintezētais proteīns ir nepareizs un tas ir jādegradē

12. Ala • tmRNS tRNS daļa (melna) pievieno alanīnu augošajai polipeptīda ķēdei • mRNS daļa (sarkana) iekļūst ribosomā un proteīna sintēze tiek turpināta ar normālo tRNS (zila) palīdzību, kamēr tiek sasniegts tmRNS sastāvā esošs terminācijas kodons • Gala rezultātā ribosoma tiek atbrīvota un uzsintezētais, parasti defektīvais proteīns satur degradācijas signālu C-galā 3’

13. Regulatorās ncRNS • Transkripcijas regulatori • Translācijas regulatori • Proteīna funkcijas modulatori • RNS un proteīnu sadalījuma regulatori

14. Cis- un trans- regulatorās ncRNS • Trans- darbības ncRNS mijiedarbojas ar citām RNS, DNS vai proteīniem • Cis- darbības ncRNS parasti ir atrodamas mRNS 5’ netranslējamos rajonos (5’UTR) un tās ietekmē mRNS translāciju

15. Devas kompensācija • Daudziem dzīvniekiem atšķirīgiem dzimumiem ir dažāds X hromosomu skaits (t.i. 1 or 2) • Lai abos dzimumos līdzsvarotu ekspresiju no X hromosomas, pastāv mehānisms, kuru sauc par «devas kompensāciju»

16. Devas kompensācijas mehānisms dažādos organismos

17. roX ncRNS loma Drosophila devas kompensācijā roX1 un roX2 ncRNS tiek ekspresētas tikai tēviņiem un tās iniciē MSL (Male Specific Lethal) kompleksa veidošanos. MSL komplekss acetilē H4 histonus X hromosomās, tādejādi dekondensējot hromatīnu un veicinot transkripciju MSL kompleksam ir aptuveni 35 iekļuves vietas drozofilu X hromosomā. Divi no tiem sakrīt ar roX1/rox2 gēniem. MLE helikāze MSL-2 MSL-1 MOF histonu acetilāze MSL-3 2 x MSL-3 roX1/roX2 ncRNS

18. Acetilēti lizīni

19. Vienas X hromosomas noklusēšana («silencing») zīdītājos • Vienas X hromosomas noklusēšana regulē Xist – a 16,000 nt gara ncRNS • Xist piesaista īpašu histonu izoformu – H2A1.2, kura uztur hromosomu neaktīvā stāvoklī • Papildus tam, Xist saturošie kompleksi piesaista histonu deacetilāzes un metilāzes, kuras palīdz kondensēt hromatīnu • Xist regulē cita 40,000 nt gara ncRNS – Tsix, kura satur Xist anti-sense sekvenci un tādejādi var regulēt Xist aktivitāti • Xist ncRNS kompleksam ir viena ieejas vieta X hromosomā, kura atbist pašam Xist gēnam

21. Ģenētiskā imprintēšana • Ģenētiskā imprintēšana ir epiģenētisks process, kurš nodrošina tikai vienas gēna allēles ekspresiju, bet allēle no otra vecāka tiek noklusēta • Noklusēšana tiek panākta ar histonu un DNS metilēšanas palīdzību • Ģenētiski imprintēti ir < 1% zīdītāju gēnu • Process ir līdzīgs devas kompensācijai, tikai tiek noklusēti atsevišķi gēni, nevis visa hromosoma • Procesā ir iesaistītas ncRNS • Piemērs: Kcnq1 lokusa gēnu noklusēšana paternālajā allēlē ar Kcnqot1 ncRNS palīdzību • Kcnqot1 ncRNS (arī ekspresēta paternālajā allēlē) rekrutē proteīnu kompleksu, kurš metilē histonus

22. Translācijas regulācija • Translācijas regulāciju var panākt ar anti-sense mehānismiem, kur ncRNS piesaistas mērķa mRNS • Ar anti-sense mehānismiem var panākt gan translācijas represēšanu (pārsvarā gadījumu), gan aktivēšanu • RNS interference arī balstās uz anti-sense principu

23. HFE promoters Sense eksoni Anti-sense promoters Anti-sense eksoni HFE mRNS A Ribosome B Anti-sense RNS H. Sapiens HFE gēna translācija tiek represēta ar anti-sense ncRNS palīdzību

24. DsrA ncRNS E.coliaktivē ribosomas piesaistīšanos pie stresa atbildes s faktora rpoS mRNS Ribosomas piekļuves vieta (RBS) ir bloķēta ar RNS sekundāro struktūru DsrA RNS rpoS mRNA RBS ir pieejama, jo DsrA ir izveidojis citu, stabilāku sekundāro struktūru

25. Mikro RNS - miRNS • Nelielas (20-26nt) RNS molekulas, kuras ar komplimentaritātes palīdzību piesaistās pie atbilstošajām mRNS un bloķē translāciju vai ierosina mRNS degradāciju • Zīdītāju miRNS parasti daļēji komplementāri piesaistās pie mRNS 3’netranslējamiem rajoniem (3’UTR) • Augu miRNS parati pilnīgi komplimentāri piesaistās mRNS kodējošajiem vai nekodējošajiem rajoniem • Tā kā dažādām mRNS var būt līdzīgi 3’-UTR, zīdītājos viena miRNS var inhibēt daudzu mRNS translāciju • Cilvēka genomā ir vismaz 1000 dažādas miRNS, kuras represē ap 60% no visu gēnu ekspresijas

26. miRNS avoti un procesēšana miRNS gēns cits gēns • miRNS var kodēt īpaši miRNS gēni vai citu gēnu introni • RNS transkriptu – pri-miRNS sašķeļ enzīmu komplekss – Drosha un Pasha • Intronu miRNS tiek atzarota • Abos gadījumos tiek iegūta daļēji divpavedienu cilpkāta RNS struktūra – pre-miRNS • Pēc eksporta uz citoplazmu enzīms Dicer vēlreiz RNS sašķeļ • miRNS saistās ar proteīniem, veidojot RISC kompleksu (zināms arī kā miRNP) • miRNP represē translāciju Introns Kodols Citoplazma

27. Drosha & Pasha – not a Russian short story... • DROSHA – apzīmējums, kuru ieviesa gēnu nomenklatūras komiteja • PASHA = PArtner of DROSHA, saukts arī DGCR8 • Drosha satur RNāzes aktivitāti, bet Pasha ir RNS piesaistošs proteīns, kurš ir nepieciešams Drosha aktivitātei

28. miRNS editēšana • Dažas pre-miRNS tiek pakļautas adenozīna deaminēšanai par inozīnu • Zīdītājiem līdz 15% miRNS ir pakļautas editēšanai, kas ir ļoti daudz, salīdzinot ar mRNS • Editēšana var izmainīt miRNS specifitāti, stabilitāti un transportu uz citoplazmu

29. miRNS darbības mehānismi • 40S ribosomas subvienības piesaistes bloķēšana (M1) • 60S ribosomas subvienības piesaistes bloķēšana (M2) • Elongācijas inhibēšana (M3) • Priekšlaicīgas terminācijas iniciēšana • Kotranslacionāla proteīna degradācija • mRNS lokalizēšana P-rajonos («P-bodies») • mRNS destabilizācija (piem. deadinilēšana) (M7) • mRNS sašķelšana (M8) • Transkripcijas inhibēšana ar hromatīna remodelēšanu (vienīgais miRNS iniciētais process, kas nedarbojas tikai uz translāciju un notiek kodolā)

30. miRNS un saslimšanas • miRNS defekti vai ekspresijas izmaiņas var izraisīt vai ietekmēt dažādas slimības, t.sk. sirds un asinsvadu slimības, nervu slimības, diabētu, aptaukošanos,, u.c. • Mutācija miR-96 miRNS izraisa progresējošu kurlumu • miR-17~92 miRNS klāstera delēcija izraisa defektus skeleta attīstībā • Let-7 miRNS saimes pārekspresija ir saistīta ar aptaukošanos. Let-7 komplementāru RNS («antagomiru») injicēšana peļu modeļos ievērojami samazināja aptaukošanos • Ir izveidota īpaša miR2Disease datubāze, kur ir anotētas miRNS sakarības ar saslimšanām

31. miRNS un vēzis • Daudzas miRNS ir asociētas ar konkrētiem vēža veidiem - tiek sauktas arī par «onkomiriem» («oncomirs») • Onkomiru detektēšana profilēšana var palīdzēt audzēju agrīnā atklāšanā, klasifikācijā un prognostikā • Noteiktu miRNS pārekspresija var izsaukt audzēja supresēšanu (ja supresējamās mRNS kodētais proteīns ir oknogēns) vai arī tieši otrādi – aktivēšanu (ja mērķa proteīns ir audzēju supresors)

32. RNS interference (RNSi) • Dabīgs bioloģisks mehānisms gēnu noklusēšanai • Dabā pastāv kā aizsardzība pret patogēniem • Ļoti potents mehānisms mākslīgai gēnu noklusēšanai eikariotiskajās šūnās • Mehānisms ļoti līdzīgs, kā miRNS gadījumā, bet mērķa mRNS tiek sašķelta, nevis vienkārši represēta translācija

33. Kā atklāja RNSi ? • Fire A et al. Nature 391:806-11 • 2006. gadā par pētījumu piešķīra Nobela Prēmiju • Gēna noklusešanuCaenorhabditis elegansembrijosbija paredzēts panākt ar anti-sense RNS • dsRNS tika izmantota kā negatīvā kontrole • Izrādījās, ka dsRNS ir vēl efektīvāka par anti-sense RNS. A- negatīvā kontrole B- mex-3 normālā ekspresija C- ekspresija anti-sense RNS klātbūtnē D- ekspresija dsRNS klātbūtnē

34. Kā darbojas RNAi gēnu noklusēšana? • Pēctranslācijas process • Notiek citoplazmā • Dicer proteīns sašķeļ dsRNS 19 bp garos gabalos • RISC komplekss piesaista dsRNS gabalu un atdala vienu ķēdi • Mērķa mRNS tiek atpazīta pēc komplimentaritātes principa • Perfektas komplimentaritātes gadījumā notiek mRNS šķelšana RISC - RNA induced silencing complex

35. RISC komplekss • RISC kompleksā ir argonauta proteīns (saīs. «ago»), kurš piesaista miRNS vai siRNS • si/miRNS piesaistīšana notiek ar RLC (RISC loading complex) palīdzību • Piesaistītā dsRNS kopā ar argonautu veido pre-RISC kompleksu • Argonautu proteīniem ir t.s. «slicer» aktivitāte, kas atdala abus RNS pavedienus izmantojot ATP hidrolīzē iegūtu enerģiju • Argonautam ir arī RNāzes aktivitāte, kas nodrošina mērķa mRNS sašķelšanu • Cilvēka genoms kodē vairākus ago proteīnus (ago1, ago2...) ar nedaudz atšķirīgām funkcijām • RISC komplekss var saturēt vēl vairākus proteīnus siRNS ATP ADP Ago2 RLC Ago2 Ago2 RNS pavedienu atdalīšana RISC pre-RISC

36. Argonauti...? • Mutācija argonauta proteīna gēnā arabidopsis augā izsauc fenotipu, kas vizuāli atgādina argonautus (dzīvniekus...) H. Sapiens argonauta proteīns ago2 kompleksā ar miRNS

37. RNAi tehnoloģiju ierobežojumi zīdītāju šūnās Ķīmiski sintezēta siRNA dsRNS ( >30 nt ) Ar Dicer sašķelta,in vitro transkribēta dsRNS Vispārēja interferona atbilde Efektīva, bet pārejoša gēna noklusēšana Globāla mRNS translācijas inhibēšana

38. RNSi : Sēnes, augosuntārpos Insektosunzīdītājos • noklusēšana ir tikai šūnas robežās un neizplatās uz blakus esošajām šūnām • nav pārmantojama • siRNSnepavairojas • noklusēšana ir sistēmiska • pārmantojama • siRNS pavairojas ar RNS-atkarīgajām RNS polimerāzēm RNSi ir pārejoša

39. RNSi un miRNA translācijas represijas salīdzinājums • mikroRNS (miRNS) nav perfekti komplimentāras mērķa mRNS • miRNS neinducē mērķa mRNS sašķelšanu, bet bloķē translāciju • miRNS parasti kodē pats organisms un tās ir iesaistītas normālos šūnas procesos, bet siRNS avots parasti ir ārpusšūnas un aktivitāte saistīta ar cīņu pret patogēneim

40. RNS inducētā transkripcijas noklusēšana (RITS) • Novērota rauga S. Pombe heterohromatīna veidošanā centromēru rajonā • siRNS vispirms piesaistās t.s. ARC kompleksam, pēc tam viens RNS pavediens – RITS kompleksam • RITS ir līdzīgs RISC, arī satur argonautu un papildus proteīnus • RITS komplekss tiek transportēts uz kodolu, kur ar siRNS palīdzību piesaistās aktīvi transkribētajai mRNS un rekrutē histonu metilāzes • Rezultātā gēns kļūst transkripcionāli neaktīvs • Pagaidām nav skaidrs, vai līdzīgu procesu var ierosināt arī zīdītāju šūnās Citoplazma Kodols

41. Pārskats par si/miRNS, mRNS šķelšanu, translācijas represiju un transkripcijas noklusēšanu siRNA miRNA

42. piRNS • piRNS (piwi-interacting RNA) • Iesaistītas retrotranspozonu un citu ģenētisko elementu noklusēšanā dzimumšūnās, īpaši spermatoģenēzē • Mijiedarbojas ar piwi proteīniem (P-element induced wimpy testis) • Piwi proteīni satur t.s. P domēnu, kuram ir RNāzes aktivitāte • Argonautu katalītiskais domēns ir P domēns

43. piRNS • Nedaudz garākas par miRNS (piRNS: 26-31 nt, miRNS: 20-26 nt), nav cilpkāta struktūras • Darbības mehānisms līdzīgs, kā siRNS gadījumā, bet ar atšķirīgiem argonautu proteīniem – PIWI, ago3 vai Aub • Bioģenēze ir atšķirīga no miRNS • Zīdītājiem ir vairāk kā 50,000 dažādu piRNS, klāsterveidīgi izvietotas genomā • Tātad, zīdītājiem piRNS kopskaits ir lielāks nekā visu citu ncRNS skaits kopā ņemot

44. miRNS / piRNS piRNS gēns miRNS gēns RNS pol II RNS pol ? Drosha/Pasha RNAse III ? Dicer PIWI/Aub/Ago3 RISC

45. ncRNS loma proteīnu funkcijas modificēšanā • Dažas ncRNS var piesaistīties pie proteīniem, izmainot to struktūru un/vai aktivitāti • Šādu ncRNS mērķproteīni parasti ir iesaistīti transkripcijā

46. 6S RNS modificē s70 funkciju E.coli un represē transkripciju no s70 promoteriem stacionārajā fāzē Logaritmiskā fāze Stacionārā fāze s70 RNA pol + + + 6S RNS Gēna transkripcija

47. Pārslēgšanās atpakaļ uz logaritmisko fāzi notiek ar dnRNS palīdzību, kura regulē 6S RNS aktivitāti • Ja barības vielu kļūst vairāk, pieaug arī nukleotīdu daudzums • RNS polimerāze sāk sintezēt dnRNS, kā matricu izmantojot piesaistīto 6S RNS • Izmainās 6S RNS struktūra, tā tiek degradēta un s70-RNS polimerāzes komplekss atkal atpazīst s70 promoterus dnRNS dnRNS sintēze Strukturālas izmaiņas RNA pol s70 disociācija + degradācija

48. Riboslēdži • Riboslēdzis ir regulatorais elements mRNS sastāvā, kurš spēj piesaistīt kādu nelielu organisku molekulu, tādejādi regulējot mRNS aktivitāti • Piesaistāmās molekula parasti ir metabolīts, kura sintēzē ir iesaistīts mRNS kodētais enzīms • Metabolīta piesaistīšanās rezultātā mRNS translācija tiek bloķēta • Ar ļoti nedaudziem izņēmumiem riboslēdži ir sastopami tikai baktērijās

49. Riboslēdžu darbības mehānismi • Riboslēdzis var veidot cilpu un bloķēt piekļuvi ribosomas piesasitīšanās sekvencei (RBS) Ribosoma A G G A AGGAGGAAAUGUUCAUG... G G AAAUGUUCAUG... - metabolīts

50. Riboslēdžu darbības mehānismi • Riboslēdzis var ierosināt priekšlaicīgu transkripcijas terminācijas cilpas veidošanos RNS polimerāze RNS polimerāze AUAAUU AUAAUU CGATATTAA... CGATATTAA... - metabolīts