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形态学研究及其 方 法 进 展

形态学研究及其 方 法 进 展. 宋天保 2006 年 10 月. 形态学研究思路和方法 免疫组化方法进展 基于 PCR 的原位检测技术. 1. 形态学研究思路和方法. 1.1 形态学发展简史. 解剖学的发展 Galen(130 - 200) 《 论解剖过程 》,《 论身体各部器官的功能 》 Vesalius(1514 - 1564) 《 人体的构造 》(1543). 1. 形态学研究思路和方法. 光学显微镜的发明 Leeuwenhoek(1632-1723) Hooke(1635-1702)

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形态学研究及其 方 法 进 展

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  1. 形态学研究及其 方 法 进 展 宋天保 2006年10月

  2. 形态学研究思路和方法 • 免疫组化方法进展 • 基于PCR的原位检测技术

  3. 1. 形态学研究思路和方法 1.1 形态学发展简史 • 解剖学的发展 • Galen(130 - 200) 《论解剖过程》,《论身体各部器官的功能》 • Vesalius(1514 - 1564)《人体的构造》(1543)

  4. 1. 形态学研究思路和方法 • 光学显微镜的发明 • Leeuwenhoek(1632-1723) • Hooke(1635-1702) • 《显微图谱》（1665）

  5. 1. 形态学研究思路和方法 • 细胞学说的建立和完善 • Schleiden(1804-1881) • “植物发生论”（1838） • Schwann(1810-1882) • “关于动植物的结构和生长一致性的显微研究” (1839) • Virchow(1821-1902) • 《细胞病理学》(1858) • “omnis cellula e cellula”

  6. 1. 形态学研究思路和方法 • 电子显微镜的发明和超微结构研究 • Knoll和Ruska(1932) Nobelprize1986

  7. 1. 形态学研究思路和方法 • 现代形态学的发展 • 细胞(组织)化学,免疫细胞化学,原位分子杂交,细胞培养等 • 向定量化、自动化和数字化发展

  8. 1. 形态学研究思路和方法 1.2 形态学的作用和地位 (1)探索生命活动的结构基础 (2)为某些学说的建立提供形态基础 如:神经元学说,肌丝滑动学说 (3)在生命科学研究中的地位逐渐上升 (4)与机能学研究相辅相成 Nobelprize 1906

  9. 1. 形态学研究思路和方法 1.3 形态学研究的思路 (1) 水平： 大体观测(器官)—立体显微镜(组织)--光镜(细 胞)—电镜(亚细胞)--扫描探针显微镜(分子和原 子) (2)对象：活体—离体培养 —固定组织 (3)方法:

  10. 1. 形态学研究思路和方法 选用形态学方法时的基本思考： • 研究目的 • 有无必要 • 选用何种方法 • 有无条件 • 高质量照片 • 结合其他资料分析 • 注意人工假象(预成论,凤汉小体…)

  11. 1. 形态学研究思路和方法 • 1.4 形态学研究的方法 • (1)普通光镜术： • 常规方法:固定—切片--染色(H-E) • 特殊染色:

  12. 1. 形态学研究思路和方法 (2)特殊光镜术： • 荧光显微镜 • 相差显微镜

  13. 1. 形态学研究思路和方法 • 暗视野显微镜 • 激光共聚焦扫描显微镜

  14. 1. 形态学研究思路和方法 (3)电镜术： • 透射电镜术 • 扫描电镜术 • 冷冻蚀刻术

  15. 1. 形态学研究思路和方法 (4)组织(细胞)化学术： 糖,脂类.蛋白,核酸,酶等

  16. 1. 形态学研究思路和方法 (5)放射自显影术：

  17. 1. 形态学研究思路和方法 (6)免疫组织(细胞)化学术： PAP,ABC,SP

  18. 1. 形态学研究思路和方法 • (7)原位杂交： • 探针:DNA,RNA,ODN • 标记物: • 放射性核素 • 非放射性 • 显示:放射自显影 • 免疫组化 • 荧光

  19. 1. 形态学研究思路和方法 (8) 细胞培养术：

  20. 1. 形态学研究思路和方法 (9) 活体与活细胞染色：

  21. 1. 形态学研究思路和方法 (10) 形态研究的定量术： • 形态计量术(体视学) • 显微分光光度术 • 图像分析术 • 流式细胞术

  22. 2. 免疫组化方法进展 2.1 EPOS法(enhanced polymer one step method) 原理：酶(HRP)+惰性聚合物(葡聚糖)→酶标聚合物 + AB1 →酶-聚合物-AB1 方法：酶-聚合物-AB1→显色。 变法：(rapid microwave one step method,RAMOS) 加酶-聚合物-AB1→盖玻片 →微波炉→显色

  23. 2. 免疫组化方法进展 特点：只有1步，特异性强； 敏感性高（70 mole酶/1 mole聚合物）； 简便、快速; 适用于石蜡、冰冻切片，细胞涂 片等。 RAMOS法还有： 试剂用量少，成本低； 无脱片现象； 无边缘现象，染色均匀。

  24. 2. 免疫组化方法进展 2.2 EnVision法 原理：酶(HRP)+惰性聚合物(葡聚糖)→酶标聚合物 + AB2 → AB2-聚合物-酶(含100个酶、15个Ab2分子) 方法：AB1→ AB2-聚合物-酶→显色

  25. 2. 免疫组化方法进展 特点： 敏感性高; 背景低（体内无葡聚糖）; 孵育时间短（37℃, 15 min）,适用于术中 病理诊断; Ab1最好用单抗，浓 度可大一点

  26. 2. 免疫组化方法进展

  27. 2. 免疫组化方法进展 2.3 CSA法(catalyzed signal amplification) 原理：基本方法为SP法 加用生物素标记酪胺 HRP催化酪胺使之沉积在Ag-Ab结合位点

  28. 2. 免疫组化方法进展 方法：AB1 → AB2-Bio → SA-HRP →酪胺-Bio → SA-HRP →显色 优点：敏感性高; Ab1稀释度高，背景染色低; 省时; 适用于信号弱的组织（戊二醛固定）; 第2次用的SA亦可用荧光素、胶体金、AKP标记; 也可用于放大原位杂交信号.

  29. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR • 3.1 原位PCR • 定义：将PCR的高效扩增与ISH的细胞定位相结合，在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定DNA或RNA序列，同时对含靶序列的组织细胞进行形态学分析。 • 分类： • 原位PCR：以DNA为起始模板→PCR扩增→检测扩增产物。又分直接法和间接法 • 原位反转录PCR：以mRNA为起始物→反转录成cDNA→以cDAN为模板行PCR扩增→检测扩增产物。 • 原位再生式序列复制反应：以mRNA为模板直接扩增RNA靶序列。

  30. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.2 直接法原位PCR 特点：PCR扩增时用标记dNTP或引物,使扩增产物直接 标记 标记物：常用同位素、生物素、地高辛 操作程序： 组织细胞制备：固定、预处理 原位扩增：引物, TaqDNA聚合酶,标记dNTP 扩增产物检测：放射自显影，ICC

  31. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 评价： 优点：操作简便、流程短、省时 缺点：特异性差，假阳性率高（固定、包埋、制片等使 标本内DNA受损， DNA修复时，标记dNTP进入非靶 序列；引物与模板的错配） 扩增效率低 不适用于切片标本（切片比细胞标本DNA受损重）

  32. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.3 间接法原位PCR 特点：PCR体系中dNTP和引物均不标记 PCR扩增结束后用标记探针行原位杂交 标记物：以生物素、地高辛较为常用 操作程序： 渗入和原位扩增：dNTP，引物, Taq DNA聚合酶 组织细胞制备：固定、预处理 原位杂交： 用特异性标记探针 扩增产物检测：ICC

  33. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 评价：目前最常用 优点：扩增效率高 特异性强（杂交探针特异性结合靶序列，不与扩增 产物中的非靶序列结合） 可用于细胞制备和石蜡切片标本 缺点：操作复杂

  34. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 举例：石蜡切片，Dig标记 ②PCR热循环：94℃ 1’，55 ℃ 1’， 72℃ 1.5’， 25-30个循环， 72℃延伸 10’； ③去盖片，4%多聚甲醛后固定10’； ④ Alc脱水干燥。 原位杂交： ①Dig标记探针，98 ℃变性10’，-20 ℃退火5’，42 ℃杂交过夜； ②洗涤：2×SSC 10’ ×3，1×SSC 10’ ×3，缓冲液洗10’ ×3； ③AKP-Dig-Ab，37 ℃，2h; ④BCIP/NBT显色； ⑤脱水、透明、封固。 标本制备：10%福马林固定，石 蜡切片5 m。 预处理： ①脱蜡至水; ②0.2mol/L HCl，10’; ③5 g/ml 蛋白酶K 37℃ 10’; ④RNase消化37℃ 30’; ⑤Alc脱水干燥。 原位扩增： ①PCR扩增反应液30 l，加盖片封边;

  35. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.4 原位RT-PCR 原理： 逆转录酶 mRNA为模板 cDNA Taq聚合酶 cDNA为模板扩增产物 直接（直接法）或原位杂交（间接法）检测扩增产物 注意： 标本先以DNase处理过夜，破坏DNA 反转录条件42℃,30’-60’ 反转录后加热90℃以上灭活逆转录酶

  36. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 程序： 组织细胞制备：10%福马林固定。 预处理：DNase消化过夜；蛋白酶K消化（54℃,20’）；95℃,3’灭活蛋白酶K。 逆转录反应：反应液含逆转录酶、引物、dNTPs，并有RNase抑制剂,42℃,30’-60’。 95℃10’灭活逆转录酶。 PCR扩增：加Taq聚合酶、引物、dNTPs扩增；扩增后烤80℃, 15’-30’。 原位杂交：原位杂交后或直接用ICC检测扩增产物。

  37. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.5 原位再生式序列复制反应(原位3SR反应) 原理：直接进行RNA扩增，检测细胞内低拷贝mRNA 特点：3种工具酶：AMV逆转录酶、RNase H、T7RNA聚合酶 引物5’端有T7RNA聚合酶启动子 扩增反应42℃，2h，不需热循环 程序：细胞固定、脱水干燥； 制备5’端含T7启动子的引物； PCR制备标记探针（Dig-11-dUTP）； 原位扩增（反应液含引物、dNTPs、3种酶等）； 原位杂交（加探针95℃变性10’， 40℃杂交过夜，显色）

  38. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.6 原位PCR的对照试验 已知阳性、阴性对照试验 省去或用无关引物替代特异性引物 标本用DNase或RNase预处理 直接、间接原位PCR中省去DNA聚合酶 原位RT-PCR和原位3SR反应中省去逆转录酶

  39. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.7 原位PCR的应用 检测内源性基因 固有基因定位--最敏感，低拷贝 异常及变异基因--与遗传性疾病的研究 检测外源性基因 感染（病毒、细菌）基因--诊断 转基因，基因治疗--基因定位、有无突变

  40. 3. 基于PCR的原位检测技术-原位PCR 3.8 原位PCR存在问题及对策 敏感性：在细胞制备高(单拷贝)；在切片标本低，扩增效率低 特异性：间接法高，直接法低（假阳性） 原位扩增时采用热启动PCR或套式PCR可提高特异性 引物延伸时掺入Bio-dNTPs→合成的新链体积大→不 易扩散 用针对同一靶序列不同片段的多对引物扩增→多个不 同长度扩增产物重叠交织→不易扩散，且敏感性提高 复杂性：需规范操作，需对照试验，需简化操作 定量分析：尚不成熟

  41. 4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR 4.1 免疫PCR 概述：利用细胞工程和基因工程技术，将Ag-Ab反 应的特异性与PCR的敏感性结合，用以检测Ag分子。 原理：用一中介分子同时结合DNA和Ab，Ab与Ag特异性 结合，DNA用特异引物行PCR扩增，通过显示扩增产 物对Ag进行定性和定量。 与ELISA比较：本质为ELISA，但 作用于底物的酶被结合于Ab的标记DNA分子取代； 酶标显色被PCR扩增取代。 优点：敏感性提高近1万倍，可检测含量极低的Ag。

  42. 4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR 4.2 中介分子的种类 蛋白A(PA)与链霉亲和素(SA)嵌合分子： 利用基因工程表达的嵌合分子 PA可结合IgG Fc段，SA可结合生物素化DNA; 假阳性:PA可能与标本和血清中残留Ig结合 抗体只能是IgG分子 (Ab-Bio)-SA-(Bio-DNA)： 将抗体和一段核苷酸分别生物素化，再以SA连接二者 抗体结合Ag，核酸用引物PCR扩增 单链抗体-SA融合蛋白： 利用基因工程将McAb的重链和轻链连接成单链，再与SA连接→ 单链抗体-SA

  43. 4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR 4.3 原位免疫PCR 原理：将PCR与免疫组化结合，在组织细胞原位检测抗原: 中介分子连接Ag-Ab复合物和标记DNA→Ag-Ab-DNA复合物→ PCR扩增DNA→检测扩增产物→间接证明Ag存在

  44. 4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR 方法： 石蜡切片脱蜡至水； 0.3%双氧水-甲醇20’； 3 mol/L尿素30’； 10%小牛血清37℃ 30’; Ab1 37℃ 1-2h; PBS洗; 生物素化Ab2 37℃1h; PBS洗; SA 1:100, 1h; 生物素化DNA（20ng/片）37℃1h; PBS洗后行原位PCR扩增(25l反应液加引物, dNTPs, Bio-dUTP, Taq酶等)； ABC法呈色，复染、封片。

  45. 4. 基于PCR的原位检测技术-原位免疫PCR 增加敏感性： 用放射性同位素、荧光素、酶标记物掺入PCR产物 改变Ab和中介连接物浓度 控制PCR循环周期数、改进PCR产物检测方法 注意事项： 防止非特异性：外源性DNA和引物应与被检材料固有及外来基 因无互补序列 用尿素或微波替代蛋白酶消化：防止残存酶对Taq酶的降解 充分洗涤：去除非特异结合 设立阳性、阴性对照

  46. 5. 引物介导的原位标记技术 5.1原理(primed in situ labelling, PRINS) 寡核苷酸引物或变性DNA片段与标本上靶DNA互补复性 在聚合酶作用下单次延伸（用标记dUTP）， 新合成DNA即带有标记物，检测。 复性与延伸：引物, dNTP(含标记dUTP)，Taq DNA聚合酶 组织细胞制备：固定、预处理 检测：荧光显微镜或ICC

  47. 5. 引物介导的原位标记技术 5.2方法 5.2.1染色体标本 ① 新鲜组织块胰酶消化成单细 胞，制备间期核或染色体; ② Alc脱水，空气干燥； ③ 94℃加热，并加上50 l PCR 反应液 (含引物, Bio-11-dUTP, dNTP, Taq酶), 加盖片, 5 min; ④ 65℃湿盒5’, 0.1×SSC 65℃洗 片5 min; ⑤ 65℃干燥10-20”, EDTA 5 min 终 止反应； ⑥ 4× SSC 含0.1%吐温20 42℃ 洗片5 min,2次; ⑦ 30%BSA封闭20 min; ⑧ FITC-亲合素或CY5-亲合素 37℃30’; ⑨ SSC (4× 42℃ 5 min 2次, 2×5 min)洗片; ⑩复染，甘油封片; 荧光显微镜 观察。

  48. 5. 引物介导的原位标记技术 5.2.2石蜡切片 ⑥ SSC洗 (0.1× 65℃5 min, 4× 42℃5min,2次); ⑦ 20%羊血清封闭30 min; ⑧ 地高辛抗体复合物, RT 2h; ⑨ 洗后用BCIP/NTB显色1-2h; ⑩中性红复染，封片。 ① 脱蜡至水; ② 0.2mol/L HCl，5’; ③ 25 g/ml 蛋白酶K 37℃ 15’; ④ Alc脱水干燥； ⑤ PCR反应液25 l (含引物, dNTP, Dig-11-dUTP, Taq酶), 加盖片, 94℃变性5 min, 65℃湿 盒5 min; 结果：阳性信号蓝紫色， 背景细胞核红色

  49. 5. 引物介导的原位标记技术 • 5.3对照试验 • 阳性对照：已知阳性细胞或组织； • 阴性对照： • 不加标记的dUTP; • 不加引物； • 不加Taq聚合酶

  50. 5. 引物介导的原位标记技术 • 5.4评价 • 快速（扩增只需5～10 min，全程只需1～3h）； • 简便（Taq酶驱动的单次延伸，只需特异性引物，不需探针）； • 特异性高（避免原位PCR中标本上受损DNA修复引起的非特异 • 性延伸和扩增，特异片段延伸和信号显示强而稳定）； • 既可用于细胞和染色体标本，也可用于组织切片； • 可使用Dig-11-dUTP，代替荧光标记，可用普通显微 • 镜，便于推广和避免荧光褪色。

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