第十五章核酸的研究方法

第十五章核酸的研究方法 一、核酸的分离、提纯和定量测定二、核酸的超速离心三、核酸的凝胶电泳四、核酸的核苷酸序列测定五、DNA聚合酶链反应（PCR）六、DNA的化学合成楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

一、核酸的分离、纯化和定量测定 尽可能保持其天然状态，防止降解和变性。条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌。抑制核酸酶。（一）DNA分离真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl），据此，采用高盐提取，低盐沉淀，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。DNP可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。水相中的DNA可被0.3M NaAC-70%乙醇沉淀。（二）RNA的分离 RNase 的灭活：玻璃器皿：140-200℃，8h 塑料器皿：0.1%DEPC，37，过夜提取液加盐酸胍或异硫氰酸胍反应体系中加RNasin等特异的RNase抑制剂楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

★用0.14mol/L NaCl使DNP沉淀，上清中即为RNA核蛋白（RNP）。盐酸胍、苯酚等去蛋白。 ★异硫氰酸胍/苯酚/氯仿法 ★异硫氰酸胍/氯化铯密度梯度离心法蛋白质：＜1.33g/ml DNA：1.71g/ml左右 RNA：＞1.89g/ml ★mRNA的制备： oligo(dT)纤维素（琼脂糖凝胶）亲合层析法楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

（三）核酸含量的测定方法 核酸纯度的鉴定可通过测定样品在260 nm和280nm的光吸收比值，进一步的鉴定可通过琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。 ①磷的测定RNA中含磷量为9.0％，DNA中含磷量为9.2％，因此每测得1g磷就相当于含有11g核酸。含磷量的测定是用浓硫酸将核酸消化，使其有机磷变成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，生成蓝色的钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可在660nm比色测定。从磷的标准曲线可知样品中磷的含量，从而求出核酸的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

②核糖和脱氧核糖的测定 RNA中核糖的测定用苔黑酚（3，5-二羟甲苯）法，利用RNA与浓盐酸和3，5-二羟甲苯作用生成绿色物质，在670 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的RNA的含量。 DNA中脱氧核糖的测定用二苯胺法，利用DNA在酸性条件下（冰醋酸和少量浓硫酸）与二苯胺作用生成蓝色化合物，在595 nm比色测得光吸收值。再从标准曲线中查得对应的DNA的含量。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

③紫外吸收的测定 实验室中最常用的是首先测定样品在260 nm和280 nm的光吸收值（A值），从A260／A280的比值可判断样品的纯度。纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA应为2.0。样品中如含有杂蛋白及苯酚，A260/A280比值即明显降低。不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。对于纯的样品，只要读出260mm的A值即可算出含量。通常以1A值相当于50μg/mL双螺旋DNA或40μg/mL单链DNA（或RNA）或20μg/mL寡核苷酸计算。这个方法既快速，又准确，而且不会浪费样品。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

二、核酸的超速离心 不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用CsCl密度梯度离心可以将不同构象DNA、RNA与蛋白质区分开来这一方法常用于质粒DNA的纯化。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

（一）核酸密度的测定 8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml（底部）～1.55g/ml（顶部）平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10 ρ ：浮力密度 ω ：角速度（弧度/秒） r：样品到转轴的距离楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

（二）测定DNA的G-C含量 G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系 ρ=0.100xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10 但含5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低，低于理论值。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

超螺旋DNA或 （三）溶液中核酸构象的研究浮力密度： RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质，变性程度越大，浮力密度越大

三、核酸的凝胶电泳 （一）琼脂糖电泳用于大片段DNA的分离，精度低，但分离范围广。影响迁移率的因素： ①核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③DNA的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢④电流，不大于5V/cm 染色：0.5μg/ml EB（溴化乙锭） RNA的琼脂糖凝胶电泳一般要加入甲醛或戊二醛楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

琼脂糖电泳可以用于DNA分子量的测定 琼脂糖电泳还可以用于DNA的制备与纯化（二）PAGE电泳用于小片段DNA的分析，精度非常高楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

四、核酸的核苷酸序列测定 （一）双脱氧终止法英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构， 1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法， 1980 获诺贝尔化学奖合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

双脱氧核苷酸测序法（MOV） 楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP

（二）化学裂解法Maxam-Gilbert，1977 原理：利用特异性的化学裂解法，制备出长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群经测序胶电泳和放射自显影得到测序图谱。 32P-GCTACGTA：在A处：32P-GCT和32P-GCTACGT 在G处： 32p ，32p-GCTAC 在C处：32P-G和32P-GCTA 在T处：32P-GC和32P-GCTACG 楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

G反应：硫酸二甲酯 G+A反应：甲酸/哌啶 C反应：肼/NaCl/哌啶 C+T：肼/哌啶哌啶：促使修饰化碱基脱落，并使脱碱基的磷酸二酯键断裂楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

32P *ACTTCGACAG 硫酸二甲酯（G）： *ACTTCG *ACTTCGACAG 甲酸（G+A）： *A *ACTTCG *ACTTCGA *ACTTCGACA *ACTTCGACAG 肼/Nacl（C）： *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼（C+T）： *AC *ACT *ACTT *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG 从下往上读：CTACGTA，末端G不能读出。

（三）RNA的测序 （1）酶裂解法胰RNase A：嘧啶结尾米曲霉RNase T1：鸟苷酸结尾黑粉菌RNase U2：腺苷酸结尾多头黏菌RNase Phy I：A、G、U结尾（2）化学裂解法（3）逆转录成cDNA法楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

五、DNA聚合酶链式反应（PCR） ①模板DNA（单链） ②引物 ③DNA聚合酶（Taq） ④dNTP ⑤Mg2+ PCR（MOV）

六、DNA的化学合成 固相合成法（亚磷酸三酯法）合成DNA

合成方向：3′→5′端 5′-OH用二对甲氧三苯甲基（DMT）保护。 3′-OH用氨基亚磷酸化合物活化碱基上氨基用苯甲酸保护楚雄师范学院化学与生命科学系范树国

第十五章 核酸的研究方法