การตรวจวินิจฉัยเชื้อคอตีบ ทางห้องปฏิบัติการ

1. การตรวจวินิจฉัยเชื้อคอตีบ ทางห้องปฏิบัติการ 9 พฤศจิกายน 2555 อารี ทัตติยพงศ์ Ph.D. กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ aree.t@dmsc.mail.go.th โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

2. โรคคอตีบ ผู้ป่วยยืนยัน - ไข้ เจ็บคอ มีแผ่นฝ้าสีเทาในคอ ตรวจพบเชื้อ C. diphtheriaeสายพันธุ์ ที่สร้าง diphtheria toxin พาหะ- ไม่มีอาการ แต่พบเชื้อ C. diphtheriaeสายพันธุ์ ที่สร้าง diphtheria toxin โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

3. เชื้อก่อโรคคอตีบ • Corynbacterium diphteriae • Corynbacterium ulcerans • Corynbacterium pseudotuberculosis Genus: Corynebacterium Family: Corynebacteriaceae Suborder:Corynebacteriaceae Order: Actinomycetales Phylum: Actinobacteria Kingdom: Bacteria โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

4. C. diphtheriae • พบ 1883 โดย Klebs • เพาะเชื้อได้ 1884 โดย Loffler (Klebs-Loeffler bacillus) • พบในเยื่อเมือกในจมูก คอ ของ พาหะ • aerobic, facultative anaerobic bacteria • แกรมบวก รูปแท่ง รูปร่างคล้ายกระบอง (club shape) เรียงตัวเป็นอักษร V, L, Chinese character แถวขนานกัน (palisade) • ไม่สร้างสปอร์ • Catalase บวก • Non-motile • Metachromatic granule โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

5. C. diphtheriae • 4 biotypes -var gravis -var intermedius -var mitis -var belfanti โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

6. C. diphtheriae • Disinfectant: • -1% sodium hypochlorite, • -70% ethanol, • glutaraldehyde, • formaldehyde, • iodines, • hydrogen peroxide, • peracetic acid, • quaternary ammonium compounds Survive on dry inanimate surfaces from 7 days to 6 months โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

7. ลักษณะ Colony บน BT C. diphtheriae เทา ดำ ด้าน โคโลนี ดำ เยิ้ม วาว ไม่ใช่ C. diphtheriae โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

8. ลักษณะโคโลนีบน Sheep bloodagar และ Blood tellurite agar 24 hr. Sheep bloodagar Blood tellurite agar เทา ดำ โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

9. ลักษณะโคโลนีบน Sheep bloodagar และ Blood tellurite agar 48 hr. Blood tellurite agar Sheep bloodagar โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

10. ลักษณะโคโลนี บน Tinsdale agar C. diphtheriae C. ulcerans C. pseudotuberculosis ทดสอบ cysteinase Corynebacterium diphtheriae on Tinsdale agar. The dark halo intensifies after prolonged cultivation. 72 hours, 37 °C in an aerobic atmosphere โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

11. C. diphtheriae • Toxigenic strain vs non-toxigenic strain • Bacteriophage carry tox gene • Diphtheria toxin สร้างจาก tox gene • C. diphtheriae strainต้องถูก infect โดย Bacteriophage • Toxigenic strain can cause diphtheria โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

12. Pathogenesis • Toxin • tox gene (รับมาจาก bacteriophage) • exotoxin • A-B subunit • ขัดขวางการสร้างโปรตีนของเซลล์ – เซลล์ตาย • พบแผ่นฝ้าสีเทา (pseudomembrane)เกาะที่ ต่อมทอนซิล ลิ้นไก่ กล่องเสียง หลอดลม –>block airway • toxin กระจายเข้าสู่กระแสเลือด อวัยวะต่างๆ เกิด myocarditis, neuritis etc… โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

13. การวินิจฉัยเชื้อC. diphtheriae • การเก็บตัวอย่าง และการนำส่งตัวอย่าง • การเพาะเชื้อ จากตัวอย่างผู้ป่วย • 3. ทดสอบ toxin ด้วย วิธี Elek test โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

14. การเก็บตัวอย่าง การนำส่งตัวอย่าง • - ส่งตัวอย่างไปยังห้องปฏิบัติการภายใน 24 ชม. • ถ้ายังส่งห้อง labไม่ได้ เก็บเข้าตู้เย็น • ส่งตัวอย่างถึงห้อง lab โดยแช่หรือไม่แช่น้ำแข็ง ก็ได้ • - ถ้าระยะเวลานำส่งถึงห้อง lab นานกว่า 24 ชั่วโมง ควรแช่เย็น Throat swab -ใช้ swab (nylon, rayon, polyester) ป้ายขอบแผ่นฝ้าสีเทาหรือป้ายใต้แผ่นฝ้าสีเทา (ถ้าสามารถทำได้) -ใส่ swab ลงในอาหารนำส่ง Amies media เก็บตัวอย่างก่อนให้ antibiotic โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

15. Transport medium • คุณสมบัติ • ทำให้แบคทีเรียก่อโรคเจริญช้าลง • แบ่งตัวช้าลง • ไม่ให้ตาย • ไม่ให้เชื้อประจำถิ่น overgrowth Amies with charcoal Amies without charcoal โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

16. Commercial Transport Medium Amies without charcoal Stuarttransport media

17. การเพาะเชื้อในห้องปฏิบัติการกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์การเพาะเชื้อในห้องปฏิบัติการกรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

18. ตัวอย่าง Throat swab เพาะเชื้อบน Sheep bloodagar และ Blood tellurite agar บ่ม 18-24 hr subculture เชื้อที่สงสัย บน Blood Agar บ่ม 18-24 hr ย้อมแกรม (+ bacilli, pleomorphic, chinese letter) ทดสอบ catalase ทดสอบปฏิกิริยาทางชีวเคมี บ่ม 18-24 hr อ่านผลปฏิกิริยาชีวเคมี โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

19. Day 1 1. BT 2. Sheep BA Throat swab Incubate 18-24 hr โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

20. ลักษณะโคโลนี บน BT เทา ดำ กลม ไม่วาว ส่วนใหญ่เป็น pure colony Day 2 BT เลือก colony แล้ว subculture ลงใน Blood agar Incubate 18-24 hr, 37OC Blood agar -- ß-hemolysis Strep gr. A โรคคอ ตีบทางห้องปฏิบัติการ เพ. ฤ

21. catalase:+ oxidase: - Day 3 Gram + bacilli, pleomorphic , club shape Chinese character Gram staining Incubate 18-24 hr, 37OC โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

22. Day 4 • TSI • Motile • Bile esculin • Nitrate • Urease • Esculin • CTA-base • CTA-glucose • CTA-maltose • CTA-sucrose • CTA-mannitol • CTA-xylose อ่านผล รายงานผล + - - - - - + - - - - K/A โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

23. Streptococcus pyogenes(ß-hemolytic streptococcus gr. A) - เชื้อก่อโรคในทางเดินหายใจส่วนบน - gram positive streptococci (cocci in chain) - ß-hemolysis on sheep blood agar -catalase negative, oxidase negative -Sensitive ต่อ Bacitracin -Resistant ต่อ Optochin -PYR (L-pyrrolidonyl arylmidase) positive -CAMP test -negative -antiserum A-positive, B-negative โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

24. CAMP test –negative Gram positive cocci in chain Bacitracin- sensitive PYR- positive โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

25. Pure colony • C. amycolatum • C. diphtheriae • C. jeikeium • C. minutissimum • C. pseudodiphtheriae • C. striatum • C. ulcerans • C. urealyficum Vitek 2 compact , automated bacterial identification, Drug sensitivity test โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

26. Biochemical patterns of C. diphtheriae โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

27. การทดสอบ diphtheria toxin (Elek test) เชื้อคอตีบ Anti- toxin Precipitation band Immuno diffusion assay โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

28. โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการโรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ

29. C. diphtheriae : S. pyogenes =59:23 (2.6:1) โรคคอตีบทางห้องปฏิบัติการ