第四章 抗体制药

1. 第四章 抗体制药

2. 第一节 概 述 一、抗体治疗发展过程 二、抗体的定义 三、抗体的基本结构 四、抗体的分类 五、抗体的生物学功能 六、抗体的治疗机制

3. 一、抗体治疗发展过程 1890年Behring和北里柴三郎等人用白喉毒素免疫动物发现了动物血清中有一种能中和毒素毒性作用的物质，称之为抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。

4. 抗体治疗在20世纪20年代末及30年代初达到全盛时抗体治疗在20世纪20年代末及30年代初达到全盛时 期，有一系列的抗血清制剂用于治疗肺炎球菌肺炎，脑 膜炎双球菌性脑膜炎，白喉，猩红热，麻疹等。大多数 抗体制剂来源于兔和马的免疫血清，因此被动的抗体治 疗又称为血清治疗。

5. 虽然血清治疗在临床上的疗效是肯定的，但异源血清虽然血清治疗在临床上的疗效是肯定的，但异源血清 的应用可引起严重的毒副作用，包括急性和迟发性过敏反 应，其它一些问题的存在也阻碍了血清治疗的应用，如： ① 抗血清是多种抗体的混合物，含有其他无关的免疫球蛋白，与其他抗原有交叉反应，特异性及重复性差； ② 只在感染的早期有效；③ 需静脉注射； ④ 难以确定用药剂量；⑤ 价格昂贵； ⑥血清的治疗效果依感染的病原体不同而异，如对肺炎球菌肺炎的治疗效果相当好，但对肺结核的治疗效果则相反。

6. 1935年后磺胺、青霉素等抗生素的出现，很快替代了大部分细菌感染的血清治疗。但血清治疗并没有被完全摒 弃，因为在无药可医的病情下仍需依赖某些抗体制剂：抗体制剂继续用于毒素介导的疾病，如破伤风、波特淋菌中毒和白喉等，对付毒虫咬伤抗毒素仍是首选药物。然而，相对于20世纪初的显赫，在20世纪中叶抗体治疗的地位已大大削弱了。 1940年至1980年抗体的生产和纯化技术显著提高，抗体制剂更适于静脉注射，并证实人免疫球蛋白制剂 可减少丙种球蛋白缺乏症患儿的感染。

7. 1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了1975年杂交瘤技术的创立给抗体的研究及应用带来了 突破。单克隆抗体作为临床诊断、治疗、预防以及基础理 论研究（如纯化蛋白、免疫沉淀、免疫细胞化学等）的新 型制剂，已日益显示出重要的作用和广阔的应用前景，以 单克隆技术为主要产品的生物技术已成为具有巨大市场潜力的新兴产业部门。

8. 但由于目前难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，使用于临床包括体内诊断（如标记放射性核素的抗肿瘤单抗用于恶性肿瘤的术前定位及术后追综观察）及体内治疗（如抑制移植排斥反应、抗肿瘤、抗感染等）的单抗大多来源于小鼠和大鼠。在人体内使用鼠源单抗，会被作为外源性但由于目前难以获得大批量的人类杂交瘤抗体，使用于临床包括体内诊断（如标记放射性核素的抗肿瘤单抗用于恶性肿瘤的术前定位及术后追综观察）及体内治疗（如抑制移植排斥反应、抗肿瘤、抗感染等）的单抗大多来源于小鼠和大鼠。在人体内使用鼠源单抗，会被作为外源性 蛋白抗原而产生人抗鼠免疫球蛋白（human anti-murine antibodies, HAMA）。

9. 病人接受小鼠单抗后，一般在两周左右就会产生病人接受小鼠单抗后，一般在两周左右就会产生 HAMA,后者会迅速清除由静脉注入人血液中的小鼠单抗，妨碍小鼠单抗与抗原或靶细胞的结合，从而降低单抗的治疗效应。更为重要的是，HAMA可在人体内与小鼠单抗结合产生类似血清病的变态反应，并对清除抗体的器官产生毒性损害，因而限制了鼠源性单抗在临床上的反复长期使用。

10. 自20世纪80年代以来，随着分子生物学的发展，许多学者将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程和蛋白质工程技术相结合，试图改造小鼠单抗，使之人源化，基因工程抗体从此诞生。其构建灵活，既能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性，延长其在人体内的半衰期，又可将抗体的部分片段与无关序列相连接或被其它功能性分子所取代，使抗体除了与抗原结合，还能发挥其自20世纪80年代以来，随着分子生物学的发展，许多学者将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程和蛋白质工程技术相结合，试图改造小鼠单抗，使之人源化，基因工程抗体从此诞生。其构建灵活，既能通过减少抗体中的鼠源成分降低免疫原性，延长其在人体内的半衰期，又可将抗体的部分片段与无关序列相连接或被其它功能性分子所取代，使抗体除了与抗原结合，还能发挥其 它效应。 基因工程抗体制备技术已逐渐从实验室走向临床，并在多种疾病的治疗方面展示了光辉的前景。

11. 二、抗体（antibody, Ab）的定义 抗体是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的终末B细胞—浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

15. 丙种球蛋白 免疫球蛋白

16. 三、抗体分子的基本结构 1．四肽链结构： 所有抗体分子单体的基本结构均由4条肽链组成，包括2条完全相同的重链（heavy chain, H链）和2条完全相同的轻链（light chain,L链），轻链与重链间及2条重链间以二硫键相连，形成一“Y”字型结构。完整抗体的相对分子质量约为150kDa。

17. 2．可变区与恒定区： 重链及轻链N端部分的氨基酸组成及排列变化多端，称为抗体可变区（约占重链1/4～1/5及轻链1/2）（variable region，V区）；V区以外的结构氨基酸组成、数量、排列则相对恒定，称为抗体的恒定区（constant region, C区）,该区主要发挥抗体分子的相应功能。

18. 3．超变区与框架区： V区中某些特异位置上的氨基酸残基随抗体特异性不同而出现极大的变异，这些区域称为超变区(hypervariable region, HV)或互补决 定区（complementarity determining region, CDR）,是V区中特异结合抗原的部位。 V区中CDR以外的部分称为框架区（frame-work region,FR）,FR区为β片层结构，氨基酸组成相对保守，不与抗原分子直接结合，但对维持CDR的空间构型起着极为重要的作用。 重链、轻链上各有3对CDR(CDR1、CDR2、CDR3),每个CDR长 约5～16个氨基酸。

19. 抗体结构示意图

21. 4．铰链区： Y形分子两臂和主干之间的区域称为铰链区。此区含有大量脯氨酸和二硫键，富有弹性，通过变构能与不同距离的抗原决定簇结合。此外，该区对木瓜蛋白酶和胃蛋白酶敏感，经酶水解处理后可使Ig从该区断裂为几个不同的片断。

24. 5．功能区： 免疫球蛋白分子每条多肽链可折叠为几个球状结构域，每个结构域包含约110个氨基酸残基。这些球形结构域具有不同的生物学功能，称为Ig的功能区。轻链V区和C区各有一个结构域；重链的V区也有一个结构域，但C区则包含3～4个结构域，IgG、IgA、IgD的C区各有3个结构域，这些结构域分别称为CH1、CH2、CH3；IgM和IgE的C区有4个结构域，比IgG多一个CH4。

26. 功能区的主要作用： （1）VH和VL是抗原特异性结合部位； （2）CH1～3和CL为Ig遗传标志所在； （3）IgG的CH2和IgM的CH3参与激活补体系统； （4）IgG的CH3和IgE的CH4能与多种免疫细胞的相应受体结合，由此可进一步介导免疫细胞的生物学活性； （5）IgG的CH2+CH3还具有介导IgG通过胎盘的特性。

27. 四、抗体的分类： 1．根据免疫球蛋白C区氨基酸的组成和排列顺序的差异，将免疫球蛋白命名为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。

28. 2．根据抗体制备的原理和方法不同，将抗体分为2．根据抗体制备的原理和方法不同，将抗体分为 多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体。 （1）多克隆抗体（PcAb） 抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体，这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体(polyclonal antibody, PcAb)。

29. （2）单克隆抗体（McAb） 由单一克隆B细胞克隆产生的，针对一个抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体。单克隆抗体是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。具有高度特异性。每种单克隆抗体的类、亚类、型及亲和力完全相同， 具有高度均一性。

30. （3）基因工程抗体 ③特殊类型的基因工程抗体 双功能抗体 免疫粘连素 催化抗体 ④人源化抗体 ①鼠单克隆抗体的人源化 人－鼠嵌合体 改型抗体 ②小分子抗体 Fab抗体 单链抗体 单域抗体 超变区多肽

31. 五、抗体分子的生物学功能 抗体分子上含有多个功能区，抗体分子的各个功能区分别发挥不同的生物学效应。 特异性结合抗原, 活化补体, 结合Fc受体,通过胎盘。这种特异性是由V区（尤其是V区中超变区）的空间构型决定的，是可逆的，并受到pH、温度和电解质浓度的影响。 在人类，IgG是唯一可通过胎盘从母体转移给胎儿的Ig，是一种重要的自然被动免疫，对于新生儿抗感染有重要作用。

34. 六、抗体治疗的机制 1．阻断和中和作用； 2. 免疫效应机制； 3. 信号传导； 4. 免疫调节； 5. 靶向作用；

35. 1.阻断和中和作用 抗体分子与抗原结合后阻断或中和靶分子的生物学活性是产生治疗效果的重要机制，在抑制同种免疫反应（抗移植排斥)、治疗自身免疫性疾病及抗感染等方面均有成功的作用。如： （1）抗TNF-a(肿瘤坏死因子)，人－鼠嵌合抗体 Remicade, 用于治疗炎症性疾病、类风湿关节炎；通过与TNF-a结合，阻断其诱发 病理性炎症；

36. （2）抗CD3、CD25（IL-2受体） 阻断免疫应答，抑制同种抑制排斥反应； （3）Synagis:(是一种人源化的单克隆抗体，于1998年获FDA批准用于防止呼吸道合胞病毒（RSV）感染高危婴幼儿因RSV而引起的严重下呼吸道疾病)用于呼吸道合胞病毒感染； （4）中和毒素：破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素及蛇毒的多克隆抗体。

37. 2. 免疫效应机制 抗体Fc段(相当于两条重链的CH2 和CH3)所介导的生物效应功能是抗体提供免疫保护的重要机制，目前认为，这些效应机制在抗体对恶性肿瘤的治疗作用也有重要作用。当抗体与肿瘤细胞结合后，可激活补体系统裂解靶细胞杀伤靶细胞。

38. 3. 信号传导 抗体与细胞膜抗原结合后所诱发的信号传导的改变 在肿瘤治疗中有重要作用。 如抗HER2单抗可促进细胞内蛋白质酪氨酸的磷酸 化、引起多种蛋白质激酶活性的变化等。（人表皮生长 因子受体-2(HER2)是乳腺癌的愈后重要判断因子）

39. 4. 免疫调节 在肿瘤治疗中，有一类抗体并不通过直接与瘤细胞结合起到治疗作用，而是通过对免疫系统的调节，激发宿主主动抗肿瘤免疫，到达治疗效果。 一些与免疫系统关键分子相互作用的抗体，可以增强机体的免疫应答能力，使原来较弱的、无效的抗肿瘤免疫反应得到有效的提高，对机体提供免疫保护。 如抗CD40抗体：引起APC表面CD40分子的交联，激活APC(抗原提呈细胞),提高其对肿瘤抗原的加工处理能力。(CD分子指的是与人类细胞发育、分化、活化有关的膜抗原)

40. 5. 靶向作用 天然不加修饰的单抗可以通过上述几种机制发挥治疗作用，但在许多情况下，尤其是实体恶性肿瘤，其效果不甚理想。可以利用抗体的特异性结合活性，将细胞杀伤性物质选择性导向肿瘤部位。 如：放射性核素、化疗药物、毒素等。

41. 第二节 单克隆抗体 单克隆抗体是针对一个抗原决定簇、由单一B淋巴细 胞克隆产生的抗体；单克隆抗体的结构和特异性完全相 同。 在体外将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤 细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为 纯一的单克隆细胞系而获得单克隆抗体。

42. 一、单克隆抗体的制备原理： （B细胞杂交瘤技术） 1. 细胞融合 将免疫小鼠脾细胞中的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞混合后融合，形成具有5种细胞成分的细胞混合体。其中包括未融合的骨髓瘤细胞和未融合的小鼠脾细胞，还有3种杂 交细胞分别是脾细胞与脾细胞的融合、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞的融合，以及B细胞与骨髓瘤细胞的融合，只有B细胞与骨髓瘤细胞融合细胞才有可能形成分泌特异性抗体的杂交细胞。

43. 要从这些细胞中筛选出B细胞与骨髓瘤细胞的杂交细胞，需用HAT培养液进行选择性培养。(HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基)。要从这些细胞中筛选出B细胞与骨髓瘤细胞的杂交细胞，需用HAT培养液进行选择性培养。(HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基)。

44. 2. HAT选择培养 是根据次黄嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途径设计的。通常细胞DNA的生物合成有两条途径，一条为主要生物合成途径，是利用氨基酸和一些小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA。在这条合成途径中叶酸衍生物是不可缺少的中间体，它参与嘌呤环和胸腺嘧啶甲基的生物合成。

45. 氨基喋呤是一种叶酸拮抗剂，可以阻断DNA生物合成的主要途径，在HAT选择培养基中含有氨基喋呤，因此在HAT培养液中细胞的DNA合成主要途径被阻断，需要利用另一条途径，即补救途径来合成DNA。氨基喋呤是一种叶酸拮抗剂，可以阻断DNA生物合成的主要途径，在HAT选择培养基中含有氨基喋呤，因此在HAT培养液中细胞的DNA合成主要途径被阻断，需要利用另一条途径，即补救途径来合成DNA。 利用补救途径合成DNA需依赖次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶脱氧核苷（T）等DNA前体的存在，而且细胞内要有次黄嘌呤－鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT酶）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），若缺乏其中一种酶，该补救途径便不能发挥作用。

46. 制备杂交瘤用的骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷型细胞，HAT选择性培养基能抑制融合体系中未融合的骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞形成的融合细胞。另外两类细胞（未融合的脾细胞及脾细胞与脾细胞的融合细胞）由于正常的淋巴细胞在体外培养不能长期存活（2～4周）和增殖，因此不需对其进行特殊的选择和清除，也不会干扰杂交瘤细胞的生长，因此只有B细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤才能在HAT选择培养液中生长增殖，因为脾细胞补充了骨髓瘤细胞的HGPRT缺陷。制备杂交瘤用的骨髓瘤细胞为HGPRT缺陷型细胞，HAT选择性培养基能抑制融合体系中未融合的骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞与骨髓瘤细胞形成的融合细胞。另外两类细胞（未融合的脾细胞及脾细胞与脾细胞的融合细胞）由于正常的淋巴细胞在体外培养不能长期存活（2～4周）和增殖，因此不需对其进行特殊的选择和清除，也不会干扰杂交瘤细胞的生长，因此只有B细胞与骨髓瘤细胞形成的杂交瘤才能在HAT选择培养液中生长增殖，因为脾细胞补充了骨髓瘤细胞的HGPRT缺陷。

47. 二、单克隆抗体的制备方法：

49. 1. 抗原与动物免疫 （1）抗原： A.可溶性抗原：蛋白质、碳水化合物、核酸； B.颗粒性抗原： 病毒、细菌、细胞； （2）动物的选择： 一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB／c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB／c小鼠。

50. （3）免疫方法（体内免疫法,体外免疫法） 体内免疫法： 适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8～12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原如（细菌、细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1～3周，再追加免疫1～2次。