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第十七章 分子标记辅助选择育种 Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Breeding

第十七章 分子标记辅助选择育种 Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Breeding. 标记辅助选择育种 :. 是利用与育种目标性状基因紧密连锁的遗传标记 , 对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。 常用的标记主要有四种 :. 形态标记. 细胞学标记. 生化标记. 分子标记. 第一节 分子标记的类型和作用原理. 分子标记概念 : 分子标记 ( Molecular marker ) 是指与特定基因或标记连锁的一段经过扩增并可检测出的 DNA 序列。. 一、分子标记的类型和特点 1. 类型（按技术特性分类）.

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第十七章 分子标记辅助选择育种 Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Breeding

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  1. 第十七章 分子标记辅助选择育种Chapter 17 Molecular Marker assisted Selection Breeding

  2. 标记辅助选择育种: 是利用与育种目标性状基因紧密连锁的遗传标记,对目标性状进行跟踪选择的一项育种技术。 常用的标记主要有四种: 形态标记 细胞学标记 生化标记 分子标记

  3. 第一节 分子标记的类型和作用原理 分子标记概念: 分子标记(Molecular marker)是指与特定基因或标记连锁的一段经过扩增并可检测出的DNA序列。

  4. 一、分子标记的类型和特点1.类型（按技术特性分类）一、分子标记的类型和特点1.类型（按技术特性分类） Hibridisation-based markers以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记、DNA指纹技术、原位杂交 ） 分 子 标 记 PCR-based markers以PCR反应为核心的DNA指纹技术 （RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记 、AFLP标记、STS标记 ） Sequencing based markers新型的分子标记（SNP标记、EST标记 ）

  5. 2.原理

  6. 3.程序

  7. 二、分子标记的原理和遗传特性 (一)RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)标记 1.RFLP标记的原理 植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶酶切位点的增加或丧失，从而产生限制性片断长度多态性。

  8. DNA提取 基 本 步 骤 用DNA限制性内切酶消化 凝胶电泳分离，转移到滤膜上 Southern杂交 放射性自显影或酶学检测

  9. 2.RFLP标记的特点 （1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的； （2）无表型效应，不受发育阶段器官特异性限制； （3）共显性，可区分纯合子和 杂合子； （4）结果稳定、可靠； （5）DNA需要量大，检测技术繁杂,难以用于大规模的育种实践中

  10. (二)RAPD标记 • 它是Randomly Amplificd Polymorphic DNA的英文缩写,中文意思是随机扩增多态性DNA,RAPD技术是1990年由美国杜邦公司的科学家Williams和加利福尼亚生物研究所Welsh领导的两个科研小组几乎同时发展起来的。

  11. 1.RAPD标记的原理 • 它的应用是基于这样的一个推理：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱（模板基因组间可能具有同源性），也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。

  12. 2.基本流程

  13. 3.RAPD标记的特点 • ①RAPD使用的是随机引物，不需要预先了解目的的基因和相应的序列。 • ②操作简便，实验周期短，能在较短的时间筛选大量样品。 • ③引物具有普遍适就性，适用于自动化操作分析。

  14. （三）AFLP标记 • 扩增片段长度多态性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。

  15. 1.AFLP标记的原理 • 以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。

  16. 2.实验流程 • 1、总DNA提取 • 2、EcoR1酶消化 • 3、Mse1酶消化 • 4、T4 DNA Ligase • 5、预扩增 • 6、选择性扩增 • 7、产物电泳检测

  17. AFLP流程图

  18. 3.AFLP分子标记的特点 （1）不需要事先知道DNA序列的信息，可以用于任何动植物基因组的研究。 （2）多态性丰富 （3）标记多数具有共显性表达，无复等位效应，表现孟德尔方式遗传。 （4）分析成本较高，对DNA的纯度和内切酶的 质量要求也较高。

  19. (四)SSR 1.SSR标记的原理 根据微卫星DNA两端的单 拷贝序列设计一对特异引 物，利用PCR技术，扩增每个 位点的微卫星DNA序列，通过 电泳分析核心序列的长度多 态性。

  20. 建立基因组DNA的质粒文库 基 本 布 骤 设计探针，筛选重组克隆　 对阳性克隆DNA插入序列测序 根据SSR两侧序列设计并合成引物 PCR扩增反应 凝胶电泳检测多态性

  21. 2.SSR标记的特点 （1）SSR标记为共显性标记，可鉴别出纯合子和杂合子。 （2）重复性高，稳定可靠。 （3）DNA用量少，对DNA的质量要求也不太高。 （4）使用SSR技术需要知道重复序列两翼的DNA序列。

  22. 以PCR(聚合酶链式反应)为基础的分子标记 PCR (Polymerasc Chain Rcaction),又称无细胞分子克隆法,是近年来发展起来的一种快速的特定DNA片段扩增技术。它是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro)的大量合成,基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍,从而从中筛选出所需的目的DNA 。

  23. 标准的PCR过程分为三步：1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA。2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。 现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

  24. 第二节重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。

  25. 用于MAS育种的分子标记须具备三个条件： 1.分子标记与目标基因紧密连锁 2.标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体。 3.不同遗传背景选择有效。

  26. 一、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记一、遗传图谱的构建与重要农业性状基因的标记 • 遗传作图的原理 其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。

  27. 构建遗传图谱的主要环节 • 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体。 • 对群体中不同植株的标记进行基因性分析。 • 借助计算机程序构建连锁群 构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。

  28. 用于分子标记的遗传作图可分为两类 • 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等 • 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等

  29. 自花授粉作物作图群体的构建方法 P1×P2 F1 F1 F1×P1 F1×P1 F1×P1 F2 DHL B1:BC1 B2:BC2 F3 F4 异花授粉作物作图群体的构建方法 杂合F1 ABCDEfG AbcdEfg 对B、D、G位点来说，相当于F2 对A、C、E位点来说，相当于测交 F位点不分离 × AbCDEfG aBCdefg

  30. 不同作物群体的特点

  31. 二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记二、近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记 三、群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记 四、数量性状基因的定位

  32. 第三节 作物MAS育种

  33. Marker-assisted selection for QPM maize (o2 gene) Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 SSR Phi 57

  34. Line improvement for drought: MAS scheme Mapping Trait transfer (MAS) P1 x P2 P1 x CML247 BC1F1 (400) F2 (240) { { QTL Mapping Drought Low N F2 (240) QTL Mapping Drought MAS F3 (240) BC2F1 (2200) F3 (240) MAS BC2F2 (2200) MAS { BC2F3 (2200) QTL Mapping Drought RILs (220) (S6) MAS Testers BC2F4 CML 254 and 274 Field evaluations

  35. Line improvement for drought BC2F3 genotype 755-222-407

  36. 一、作物MAS育种须具备的条件 • 分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小。 • 具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，主要是应用PCR技术。 • 筛选技术在不同实验室间重复性好，且具有经济、易操作的特点。 • 具有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。

  37. 供体 受体 目标基因与DNA标记间的遗传距离位p M R m r 利 用 MAS 的 遗 传 基 础 （以 RFLP 为 例） 亲本中DNA标记的带型 M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 M R m r F1杂种中DNA标记的带型 在F2分离群体中分子标记类型 即MM,Mm,mm MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率 RR Rr rr (1-P)2 2P(1-P) P2

  38. 二、MAS育种方法 （一）回交育种 （二）SLS-MAS （三）MAS聚合育种

  39. 受体亲本 × 供体亲本 (不含优质基因) (含优质基因) 中选BC3(含优质基因) F1 × 受体亲本 自 交 BC1 目标基因定位 标记辅助选择 新育成的优质品种 (受体亲本遗传本背景+优质基因) 中选BC1 × 受体亲本 (含优质基因) 目标基因的定位 与标记辅助回交 育种相结合程序图 BC2 标记辅助选择 中选BC1 × 受体亲本 (含优质基因) BC3 标记辅助选择

  40. 受体亲本 × 供体亲本A (无优质基因) (含优质基因A) 受体亲本 × 供体亲本B (无优质基因) (含优质基因B) F1(含优质基因A) × F1(含优质基因B) 受体亲本 × 供体亲本C (无优质基因) (含优质基因C) 复杂杂种(分离群体) 标 记 辅 助 基 因 聚 合 标记辅助选择 中选杂种个体 × F1 (含优质基因A和B) (含优质基因C) 与 品 质 改 良 相 结 合 程 序 图 复杂杂种(分离群体) 标记辅助选择 中选杂种个体 × 受体亲本 (含优质基因A、B和C) 回交1~2代，标记辅助选择 自交 新育成的优质品种 (受体亲本遗传背景+优质基因A、B和C)

  41. 三、提高分子标记的筛选效率 （一）多重PCR方法 （二）用相斥相分子标记进行育种选择 （三）克服连锁累赘 （四）降低MAS育种的成本

  42. 思考题 • 几种主要分子标记的类型及遗传特点？ • 举例说明重要农艺性状基因定位的原理和方法。 • 如何理解分子标记技术的发展对作物育种工作的贡献。

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