การตรวจวินิจฉัยโรคลิชมาเนีย โดย สวาท ชลพล

1. การตรวจวินิจฉัยโรคลิชมาเนีย โดย สวาท ชลพล 1. ทางคลินิกClinical diagnosis สอบประวัติ ดูตามผิวหนังรอยถูกริ้นฝอยทรายกัด ตุ่ม แผลหายยาก(CL) อาการไข้ หนาวสั่น เลือดออกตามไรฟัน ตับม้ามโต(VL) 2.ตรวจซีรั่มให้ผลบวกต่อเชื้อฯ(Serological diagnosis:Antibogy) หรือAntigen) - Direct agglutination(DAT) - Indirect fluorescent antibody test(IFAT) - Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) - Complement fixation test(CFT) - Indirect haemagglutination test (IHA) - Latex agglutination - Dipstick rK39 Ag. - Western-blot analysis ฯลฯ

2. 3. ตัวเชื้อโรค(Parasitological diagnosis) ตรวจหา amastigote - ย้อมสี(Stained smear) - ฉีดเข้าสัตว์ทดลอง(Animal inoculation) - เพาะเลี้ยงเชื้อ(Culture) 4. ระดับโมเลกุล(Molecular diagnosis) หา DNA เช่น PCR ซึ่งนิยมใช้อย่างแพร่หลาย และใช้แยกชนิดเชื้อลิชมาเนีย

3. การตรวจวินิจฉัยCutaneous leishmaniasisด้วยกล้องจุลทรรศน์ ตุ่ม พองใส แผลเปียก/แห้ง

4. ตุ่มพองใส ใช้ใบมีด(blade) กรีดเป็นแผลเล็กน้อย เขี่ย/ขูดเนื้อ เยื่อหรือดูดน้ำเหลืองก้นแผล :ขูดน้ำเหลืองหรือเนื้อเยื่อก้นแผล : เข็มเบอร์ 20 แทงผิวหนังข้างแผล ดูดน้ำเหลืองที่ก้นแผล เกลี่ยบนสไลด์ ย้อมสียิมซ่าตรวจหา amasigote กำลังขยาย 100x ศตม./นคม./สอ./อปท. ดำเนินการในภาคสนามได้

5. กลุ่มเป้าหมายที่ควรสำรวจ CL • คนไทยในพื้นที่มีปัจจัยเสี่ยง • แรงงานไทยกลับจากประเทศที่เป็นแหล่งแพร่โรค • แรงงานพม่า • มุสลิมที่กลับจากร่วมพิธีฮัจจ์

6. การตรวจวินิจฉัยโรคริชมาเนียด้วย DipstickTest โดย สวาท ชลพล -เป็นโรคติดต่อที่เกิดจากโปรตัวซัว(สัตว์เซลเดียว)ในสกุลริชมาเนีย -อยู่ในเซลล์เม็ดเลือดขาวของสัตวเลี้ยงลูกด้วยนมหลายชนิด -ติดต่อระหว่างสัตว์กับคนโดยผ่านการถูกแมลงริ้นฝอยทรายกัด

7. -เชื้อโรคเมื่ออยู่ในคนสามารถก่อให้เกิดโรคอาจทำให้ถึงตาย-เชื้อโรคเมื่ออยู่ในคนสามารถก่อให้เกิดโรคอาจทำให้ถึงตาย -แต่อยู่ ในสัตว์ไม่แสดงอาการของโรคเป็นสัตว์รังโรค (Carrier) สัตว์รังโรคเป็นสัตว์กัดแทะจำพวก กระรอก กระแต gerbils และสุนัขเป็นโรคของสัตว์แต่แพร่สู่คนได้ (zoonosis)

8. เชื้อ leishmaniaในคน แบ่งเป็น 3 ชนิด • 1.ก่อให้เกิดแผลที่ผิวหนัง เช่น แขน ขา Cutaneous leishmaniais:CL :ชนิดเชื้อ L.aethiopica, L.mexicana complex • 2.ก่อให้เกิดแผลตามปากและจมูก Mucocutaneous leishmaniais:ML ชนิดเชื้อ L.brazilliensis complex)

13. 3.ก่อให้เกิดพยาธิอวัยวะภายใน ตับ ม้าม อักเสบ บวมโต Visceral leishmaniasis:VL :ชนิดเชื้อ L.donovani complex, L.d.infantum, L.d.chagasi ในไทย พบ L.donovani และ L.d.infantum ส่วนเชื้อชนิดใหม่ อยู่ระหว่างตั้งชื่อว่า L.siamensis

18. การตรวจและวินิจฉัยโรคริชมาเนียการตรวจและวินิจฉัยโรคริชมาเนีย • 1.แผลตามผิวหนังและเยื่อบุ โดยวิธี • 1.1 Clinical Diagnosis ตรวจดูแผลตามร่างกาย ดูตุ่มพองใส หรือ แผล (sore)มักมีขนาดใหญ่ ขอบนูนแข็ง ตรงกลางแผลอาจแห้งหรือเป็นหนองมีน้ำเหลืองเยิ้ม จำนวนตุ่มหรือแผลขึ้นอยู่กับจำนวนครั้งที่ถูกกัดหรือระบบภูมิคุ้มกัน

19. 1.2ตรวจหาเชื้อจากแผล(Parasitological diagnosis) โดยขูดหรือตัดเนื้อเยื่อก้นแผลป้ายบนสไลด์(smear)ทิ้งไว้ให้แห้งแล้ว fixed ด้วย methanal และย้อมด้วยสี Giemsaหรือ สี Wright ใช้ตรวจหา amastigote ในเม็ดเลือดขาว ตรวจด้วยกล้องจุลทรรศน์กำลังขยาย 100x

20. กรณีเป็นตุ่มพองใส อาจใช้เข็ม เบอร์ 20 แทงและดูดเอาน้ำเหลืองหรือใช้มีดกรีดเปิดตุ่ม แล้วดูดน้ำเหลืองจากก้นแผลนำไปตรวจ

21. 2.อวัยวะภายใน(ตับ ม้าม) • 2.1 ดูลักษณะภายนอกทั่วไป • อ่อนเพลีย ผอม ท้องป่อง หลอดเลือดดำโป่งหน้าท้อง ผิวหน้าคล้ำ บวมตามมือ เท้า ตับโต ไข้ค่อย ๆ เย็นขึ้น หรืออาจเป็นกะทันหันและมักสะท้านหรือสั่นคล้ายมาลาเรีย คลื่นไส้ อาเจียน อาจมีไข้ขึ้นวันละ 2 ครั้ง ไข้สูงนายหลายสัปดาห์ (ไข้เรื้อรัง) เหงื่อซึม ปวดตามข้อ กระดูก และกล้ามเนื้อ โลหิตจาง นับจำนวนเม็ดเลือดขาวต่ำกว่า 2,000 ต่อลูกบาศก์มิลลิเมตร

22. อาจมีไข้ขึ้นวันละ 2 ครั้ง ไข้สูงนานหลายสัปดาห์ (ไข้เรื้อรัง) เหงื่อซึม ปวดตามข้อ กระดูก และกล้ามเนื้อ โลหิตจาง นับจำนวนเม็ดเลือดขาวต่ำกว่า 2,000 ต่อลูกบาศก์มิลลิเมตร • ชาย/หญิง ปกติ ประมาณ 5,000-10,000 Cell/ลบ.มม.ส่วนเด็ก 10,000-12,000 Cell

23. 2 .2 ตรวจทางน้ำเหลือง(Serological diagnosis) • คนไข้มักมี IgG ในน้ำเหลืองสูง สามารถตรวจได้ง่าย มีความไวและความจำเพาะสูง เหมาะต่อการใช้ตรวจหาโรคในกลุ่มคนที่เสี่ยงต่อการเกิดโรค วิธีที่นิยมคือ ELISA dot – ELISA, IFAT, DAT, Formal – gel reaction (ปัจจุบันไม่นิยมใช้กันแล้ว)

24. 2.3 ตรวจหาเชื้อฯ จากอวัยวะภายใน • โดยเจาะไขกระดูก (bone marrow) หรือดูดของเหลวจากตับ ม้าม ต่อมน้ำเหลือง ป้ายบนสไลด์ นำไปย้อมสี และตรวจหา amastigote ด้วยกล้องจุลทรรศน์ แต่วิธีนี้ตรวจพบเชื้อได้ยากในระยะแรก ๆ ของการติดเชื้อ

25. เกิดจากที่ริ้นฝอยทรายเพศเมียที่มีเชื้อโปรโตซัวในสกุล ลิชมาเนีย (Leishmania spp.) ที่มีเชื้ออยู่ในน้ำลายตามปากดูดและทางเดินอาหาร กัดดูดเลือดของสัตว์หรือมนุษย์เพื่อการวางไข่ ลักษณะเหมือนการดำรงชีพของยุง ชอบกัดนอกบ้าน ริ้นฝอยทรายจะอาศัยอยู่ในบริเวณที่ที่มีความชื้น มืดครึ้ม ทำรังอยู่ตามพื้นดิน ไม้ผุ จอมปลวกเก่า ตามรอยแตกแยกของสิ่งก่อสร้าง ปกติจะมีอายุเฉลี่ยประมาณ 60 วัน ออกหากินตอนพลบค่ำหรือใกล้มืด ริ้นฝอยจะบินในระดับต่ำกว่าระดับเอว และหากินห่างจากรังของมันประมาณ100-300เมตรเท่านั้น

28. ยังมีการตรวจด้วยวิธีอื่น ๆ อีก อาทิ การเพาะเลี้ยงเชื้อในอาหาร (culture) กับการฉีดเข้าสัตว์ทดลอง (Animal inoculation) แต่วิธีเหล่านี้ค่อนข้างใช้เวลานาน เหมาะสมกับการสอนและศึกษาวิจัยมากกว่า

29. วิธี PCR – based DNA มีความแม่นยำสูงสามารถใช้แยกชนิดเชื้อลิชมาเนียและดูความหลากหลายของ strain เชื้อโรคได้

30. ปัจจุบันได้มีเทคโนโลยีชุดตรวจวินิจฉัยอย่างรวดเร็ว “rK39 Dipstick Test” ตรวจซีรั่มผู้ป่วยที่มีพยาธิสภาพอวัยวะภายใน (VL) หลายประเทศโดยเฉพาะประเทศที่เป็นแหล่งแพร่โรคได้ทดสอบประสิทธิภาพชุดตรวจนี้กับผู้ป่วยและสัตว์รังโรคปรากฏทั้งความไว และความจำเพาะเป็นร้อยละ 100 เท่ากัน

31. ประเทศอินเดีย บังคลาเทศ และเนปาล ได้ใช้ชุดตรวจนี้ประเมินผลการควบคุมโรคในโครงการกำจัดโรคลิชมาเนียให้หมดไปภายในปี 2015 ตามการลงนามร่วมกันกับ WHO

32. บางประเทศได้ประยุกต์ rK39 dipstick ตรวจค้นผู้ป่วย Visceral leishmaniasis ที่ไม่ปรากฏอาการเพื่อทำนายแนวโน้มการแพร่ระบาดโรคลิชมาเนียในแต่ละพื้นที่

33. ประเทศไทย ยังไม่เคยนำเครื่องมือนี้มาทดสอบและใช้ตรวจค้นหาผู้ป่วย Visceral leishmaniasis ในที่นี้ จึงเป็นเพียงการเสนอคุณลักษณะของชุดตรวจ เพื่อประกอบการพิจารณาการดำเนินงานเฝ้าระวังโรคลิชมาเนียในอนาคต

34. ชุดตรวจอย่างรวดเร็ว rK39 dipstick test เป็นเครื่องมือใหม่ (New tool) ใช้ตรวจหาผู้ป่วยโรค • ลิชมาเนีย โดยเฉพาะผู้ที่เป็น Visceral leishmaniasis เครื่องมือนี้ใช้ง่าย สะดวก รวดเร็ว และราคาไม่แพงมากเกินไปเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอื่น ๆ ที่กล่าวมาข้างต้น

35. dipstick test เป็นแผ่นเยื่อบาง (membrane) ที่เคลือบด้วย recombinant VL antibody (rK 39) ตรงตำแหน่งทดสอบ (Test :T) และ chicken anti – protein A ที่ตำแหน่งควบคุม(Control :C)

36. แผ่น dipstick test บรรจุในซองพลาสติกที่ปิดแน่นสนิท(sealed)

37. ภาพ 1 แผ่น rK39 dipstick Test

38. ภาพที่ 2 ซองพลาสติกที่ภายในบรรจุ dipstick test 1 ชิ้น

39. ข้อควรปฏิบัติและพึงระวัง(Precaution)ในการใช้ชุดตรวจdipstick test • 1. ห้ามใช้ชุดตรวจฯ ที่หมดอายุค้นหาผู้มีเชื้อโรคลิชมาเนีย • 2.อ่านรายละเอียดวิธีการใช้ชุดตรวจในคู่มือให้เข้าใจและปฏิบัติตามขั้นตอนอย่างเคร่งครัด • 3.สวมเสื้อผ้าปกปิดส่วนต่างๆของร่างกายมิดชิด สวมถุงมือและแว่นตา รวมทั้งล้างมือทุกครั้งเมื่อเสร็จสิ้นการปฏิบัติงาน

40. 4.หลีกเลี่ยงการให้มือสัมผัสตาและเยื่อบุบาง ๆ • 5. ห้ามรับประทาน ดื่ม หรือสูบบุหรี่ ระหว่างปฏิบัติงาน • 6. ระมัดระวังอย่าให้น้ำยา buffer โดนร่างกาย

41. การเก็บรักษา dipstick test • ควรเก็บ dipstick testไว้ในตู้เย็นที่อุณหภูมิ 20-28ºซ (ไม่เก็บในช่องแข็ง) ส่วนขวด Chase buffer เก็บไว้ที่อุณหภูมิ 2-8º ซ ทุกครั้งที่ฉีกซองพลาสติกแล้ว ควรใช้ dipstick ตรวจซีรั่มผู้ป่วยภายใน 1 ชม.

42. การเก็บตัวอย่างซีรั่มการเก็บตัวอย่างซีรั่ม • 1. dipstick test ใช้ตรวจเฉพาะกับซีรั่มเท่านั้น ไม่ใช่เลือดโดยตรง • 2. เก็บซีรั่มอย่างรวดเร็วหลังจากแยกส่วนกับเซลเม็ดเลือดแดง กรณีเม็ดเลือดแดงแตก (hemolysis) จะทำให้การตรวจวินิจฉัยคลาดเคลื่อนได้

43. 3. ควรตรวจซีรั่มหลังจากแยกเก็บจากเซลเม็ดเลือดแดงทันที กรณีไม่อาจทำได้สามารถเก็บไว้ในตู้แช่แข็งอุณหภูมิ 2-8º ซ ไม่เกิน 3 วัน และก่อนทดสอบ ต้องละลายความเย็นให้หมดโดยวางทิ้งไว้ที่อุณหภูมิห้อง หลังใช้ทดสอบกับชุดตรวจแล้วต้องทิ้งไม่ควรเก็บซีรั่มแช่แข็งซ้ำ

44. ขั้นตอนการใช้ dipstick test ตรวจซีรั่ม • 1.วางขวด Chase Buffer ไว้ที่อุณหภูมิห้องให้คลายความเย็นจากการเก็บไว้ในช่องแข็งของตู้เย็น • 2.ฉีกซองพลาสติก ดึงแผ่น dipstick test วางบนพื้นราบ • 3. หยดซีรั่ม 20 µl บริเวณปลายศรชี้ของแผ่น dipstick test

45. 4. เติม Chase Buffer 2-3 หยด (150 µl) บริเวณเดียวกันกับหยดซีรั่ม • 5. กรณีซีรั่มมีเชื้อลิชมาเนียจะปรากฏแถบสีแดงตำแหน่ง T ภายใน 10 นาที หลังจากผ่านเวลา 10 นาทีไปแล้ว ผลที่อ่านได้จะคลาดเลื่อน

46. หมายเหตุ : ต้องหยดซีรั่มก่อน Chase Buffer ทุกครั้ง

47. การอ่านผล • 1. ผลบวก (Positive result) • แผ่น dipstick test ที่มีผลบวกต่อเชื้อ L.donovani complex จะปรากฏแถบสีแดง ทั้งตำแหน่ง T กับ C ดังภาพ 3 ขนาดของแถบสีแดงอาจแตกต่างกันขึ้นอยู่กับการมีจำนวนเชื้อลิชมาเนียมากหรือน้อย แม้ว่าแถบสีอาจแดงเรื่อเล็กน้อย (weakly positive) ก็ให้ระบุเป็นผลบวกเช่นเดียวกัน

48. Test line (T) Control line (C) • ภาพ 3 dipstick test แสดงผลบวก

49. 2. ผลลบ (Negative result) ปรากฏแถบสีแดงเฉพาะตำแหน่ง C เท่านั้น ดังภาพ 4 • No Test line is visible Control line (C) • ภาพ 4 dipstick test แสดงผลลบ

50. 3. ผลที่ไม่ถูกต้อง (Invalid result) • กรณีไม่ปรากฏแถบสีแดง ที่ตำแหน่ง T และ C หรือปรากฏเพียงเฉพาะแถบ T อย่างเดียว จะต้องตรวจซ้ำด้วย dipstick test ชิ้นใหม่ • พื้นที่ที่เป็นแหล่งแพร่โรค(endemic areas) ชุดตรวจมักมี ความไวส่วนใหญ่มากกว่า 90% ส่วนความจำเพาะขึ้นอยู่กับแหล่งระบาดของโรค (geographic location)