1 / 21

Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum Resultaten Verslag

DNAlab1 : Solanum. Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum Resultaten Verslag. DNAlab1 : Solanum. Waar gaat het om? Vaststellen of enkele genen die betrokken zijn bij de resistentie tegen phythophtera in de betreffende plant(en) aanwezig zijn.

bebe
Download Presentation

Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum Resultaten Verslag

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. DNAlab1: Solanum Module DNA1 Waar gaat het om? Apparatuur Techniek en practicum Resultaten Verslag Module: DNAlab1 Solanum

  2. DNAlab1: Solanum Waar gaat het om? Vaststellen of enkele genen die betrokken zijn bij de resistentie tegen phythophtera in de betreffende plant(en) aanwezig zijn. Komen de uitkomsten overeen met hetgeen kwekers van deze rassen ook claimen? Module: DNAlab1 Solanum

  3. DNAlab1: Solanum De techniek Monstername van 5 aardappelrassen.In de vriezer zitten van 5 rassen bladmateriaal:1. Doré2. Mona Lisa3. Mozart4. Texla5. Irene6. Biologische soort. We testen op de aanwezigheid van het R1 gen en het gen R3a.Beide genen zijn gedocumenteerd als betrokken zijnde bij de resistentie tegen phythophtera; er zijn er meer! Eventuele controle of deze genen ook aanwezig zijn in tomaat, erwt etc. Verder.. Module: DNAlab1 Solanum

  4. DNAlab1: Solanum De techniek DNA-isolatieHet DNA moet uit het blad worden gehaald. De fabrikant kent twee methoden: directe procedure en de verdunde procedure. Wij nemen de verdunde procedure wegens de hogere betrouwbaarheid. PCRDe PCR zal geprogrammeerd worden:fase 1: 5 min 98 gradenfase 2: 10 sec 98 graden(40x) 10 sec 52 graden 30 sec 72 gradenfase 3: 5 min 72 graden Gel-electroforese in 2% gel. Module: DNAlab1 Solanum

  5. DNAlab1: Solanum De Apparatuur Pipetten.Dit zijn dure dingen, vanwege de preciezie waarmee ze werken.Mogelijk zijn er al fixed-volume pipetten aangeschaft. Finn-tips. Deze verbruiken we veel. Een DNA-practicum moet brandschoon zijn. Elke vervuiling met vreemd DNA kan de proef verstoren; erger nog: onbedoeld toevoegen van DNAse kan DNA in no-time afbreken… Pipetpunten kosten een paar cent. Ga ze niet sparen… je andere ingredienten zijn 100-1000 x duurder! Module: DNAlab1 Solanum

  6. DNAlab1: Solanum De Apparatuur PCR: TechneCycloGene Dit is een apparaat van dik 3000 euro welke de school tijdelijk in bruikleen heeft. Voorzichtig graag. De cycler kan een programma aflopen waarbij gedurende vooraf ingestelde tijden een temperatuur wordt ingesteld. De meeste wachttijd gaat verloren met de overgang van de ene temp naar de andere. Deze cycler kan 96 epjes bevatten. De cycler heeft ook een heated lid; epjes worden aan de bovenzijde verwarmd. Module: DNAlab1 Solanum

  7. DNAlab1: Solanum De Apparatuur Vortex.Dit ding is hier gemaakt van een omgekeerde schuurmachine zonder schuurpapier. Hij schudt als een malle en dat is het enige wat ie moet kunnen. Niet bang zijn; hij maakt veel herrie Je schudt vaak maar voor 10 seconden.. O ja…Hou wel de epjes vast… anders worden ze gelanceerd! Module: DNAlab1 Solanum

  8. DNAlab1: Solanum De Apparatuur Centrifuge.Deze machine draait (helaas) maar op één snelheid: 15000 rpm. Eigenlijk is dat te snel; 10000 zou beter zijn. Na testen blijkt het plastic er tegen te kunnen. Glazen buizen knallen stuk. Zorg bij het laden, dat er evenveel massa links als rechts is.. Module: DNAlab1 Solanum

  9. DNAlab1: Solanum De Apparatuur De gel-chamber.In deze chamber wordt de agarose-gel gegoten (als ie nog warm is) en het kammetje geplaatst. Als de gel hard is, wordt de kam verwijderd. De chamber wordt op 50-100 Volt aangesloten en de electrische stroom neemt het DNA mee naar de pluspool. Voor het bekijken van het resultaat, zit in de gel de (giftige) stof EthidiumBromide. Dat kruipt in het DNA en licht op na bestraling met UV. Module: DNAlab1 Solanum

  10. DNAlab1: Solanum De techniek DNA isolatie PCR Gel gieten Gel runnen Resultaat bekijken. Module: DNAlab1 Solanum

  11. DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 1 Gebruik (latex) handschoenenen vermijdt contact met de binnenzijde van de epjes. Neem een leeg epje van 0.2 ml. Neem een 10-100 Pipet + schone tipjes en piptetteer 20 uLDilution Buffer (staat klaar) in deze ep.(Dit heb ik al voor je gedaan.) Neem een schoon objectglaasje , een (nieuw) mesje, groen tissue Snijdt óp het glas een stukje bladweefsel uit van 1,5 x 1,5 mm groot. Laat dit in de buffer vallen Neem je pipet punt en crush het blad. Module: DNAlab1 Solanum

  12. DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 2 Als het goed is, toont de oplossing nu een beetje groenig (chlorophyll) Centrifugeer het epje bij 15000 rpm gedurende 1 minuut. Zorg voor een epje aan de overzijde van de centrifuge dat nét zo vol is. (tarreren) Neem nu een tweede epje van 0.2 ml Pipetteer hierin eerst 10 uLPCR buffer-mix. (hierin zitten de dNTP’s, zouten en buffers) Pipetteer nu 0.6-0.8 uL van het supernatant (1eepje) in het tweede epje. Module: DNAlab1 Solanum

  13. DNAlab1: Solanum De techniek DNA ISOLATIE 3 Pipetteer nu 0.5 uL primer A erbij.Druk je pipetpunt tegen de ep-wandzodat de druppel dáár blijft zitten. Doe hetzelfde voor primer B Voeg nu toe 8.5 uLdNase-vrij water toe Vortex heel kort en centrifugeer 20 sec. Voeg nu 0.5 uLtaq-DNApolymerase toe en zet deze kleine hoeveelheid ook tegen de epwand. Gezien de hoge prijs van dit spul: ik doe dat wel. Vortex kort en centrifugeer 20 sec. Module: DNAlab1 Solanum

  14. DNAlab1: Solanum De techniek DNA PCR1 Onderstaande procedure zet ik klassikaal in. Het proces neemt 4-5 uur in beslag. Stel de PCR in op programma 20 aanzetten Heated lid aanzetten (achterin!) Druk op [mode] en wacht tot de melding over het gebruik verdwijnt.. Selecteer rechts bovenin nummer 20 Laadt de epjes ergens in de 96 welletje. Start door op [run] te drukken. Controleer even of de temp oploopt naar 98 graden. Je kan nu wat anders gaan doen…. Module: DNAlab1 Solanum

  15. DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel voorbereiden Je PCR loopt nu dik 4 uur. Die tijd wachten we niet af. De docent zal de verdere verwerking doen. Neem een schone erlenmeyer 250 ml. Pipetteer 80 ml TBE buffer erin (1X) Weeg af op de balans 1,6 gram agarose en voeg die toe. Gebruik de microwave om kort te verwarmen. Kan ook met bunsenbander. Alle agarose moet gesmolten zijn; een heldere oplossing. Dit is nu HEEEL heet. Laat afkoelen tot 50-60 graden Module: DNAlab1Solanum

  16. DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel gieten Pipetteer 4 uLEthidium Bromide in de erlenmeyer met afgekoelde agarose-opl. Giet zonder luchtbellen de agarose in de chamber. Plaats het kammetje bij de markering links en zorg dat dit rechtop staat en ca 8 mm van de linker ‘dam’wand. Zet de bak HORIZONTAAL. Als de gel hard is (na 40 min) kan je damwandjes weghalen. Vul de chamber met dezelfde TBE bufferoplossing (ca 400 ml nodig) als waarmee de gel gemaakt is. Er staat ca 3 mm vloeistof boven de gel, die dus geheel ondergedompeld is. Module: DNAlab1Solanum

  17. DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel laden Als het klopt, zou na 4-5 uur de PCR wel klaar moeten zijn. Zet de epjes weer in de goede volgorde in het rekje. Voeg aan elk epje 5 uLloadingdyetoe. Dit bestaat grotendeels uit glycerine en maakt het laden makkelijker doordat dit zwaarder is dan de TBE-buffer in de gel. Vortexallepjes met loadingdye. Centrifuge mag, maar is nu niet zo nodig. Neem 3 uLDNAladder in een schone epen vul aan met 5 uLloadingdyeen 10 uL water. Vortexeven. Pipetteer steeds met schone nieuwe punt 18-20 uL van elk epje in een welletje. Kies welletje 5 voor de DNA ladder. (centrale positie). Noteer goed waar welke ep-inhoud in gedaan is. Je kan het nergens meer aan zien! Module: DNAlab1Solanum

  18. DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel runnen De gel is nu geladen met 9 welletjes.Noteer goed wat waar in zit. En verwerk dat ook zo in je verslag. Steek de stekkers erin MIN = LINKS, PLUS = RECHTS. DNA loopt van MIN naar PLUS!!! Stel in op 50 Volt. Na 10-15 min plug je de stekkers in op 100 Volt. Na 6 kwartier kan je de run stoppen. (foto hiernaast was na 4 kwartier.. Giet de TBE buffer in een afsluitbare bak ( deze kan hergebruikt worden). Neem de gel niet uit de bak; deze bekijken we in het donker met een UV lamp.Maak (als het lukt een foto van het resultaat). Module: DNAlab1Solanum

  19. DNAlab1: Solanum De techniek DNA Gel bekijken Module: DNAlab1Solanum

  20. DNAlab1: Solanum De resultaten Probeer een foto te hebben van de gel. Op de foto zijn hier en daar bandjes te zien. Met behulp van de DNAladder kan je schatten hoe groot de DNA fragmenten moeten zijn. Sommige bandjes zijn helder, ander soms erg vaag. Een kwestie van hoeveelheid. Noteer goed welke bandjes je waarneemt bij welke wel. Mogelijk zie je twee bandjes in een laantje. Module: DNAlab1Solanum

  21. DNAlab1: Solanum Het verslag. Je verslag bevat deze onderdelen: Inleiding Doelstelling, verwachting, Materiaal en werkwijze met uitvoerig hoé alles wordt uitgevoerd. Resultaten met digitale foto van de gels. Discussie. Hier bespreek je de resultaten en trek je conclusies. Doe ook voorstellen voor verbetering of alternatieve uitvoeringen van het practicum. Einde. Module: DNAlab1Solanum

More Related