ELEKTROFOREZ

1. ELEKTROFOREZ

2. Elektroforez: Yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Çözünmüş durumdaki moleküllerin elektrik yüklerinin kitlelerine oranıyla belirlenen hızlarda elektriksel alanda hareket (göç) etmeleri prensibine dayanır. Bu sistemde analizi yapılacak örnek bir destek ortamına uygulanır. Bu destek ortam olarak daha çok jeller tercih edilir.

3. Katı jel desteği ile ayırımı yapılacak moleküllerin hareketi, moleküllerin yüküne, boyutuna, biçimine kimyasal içeriğine ve uygulanan elektriksel alana bağlıdır. Elektroforezin bir homojenattaki farklı molekülleri ayırma kapasitesi genellikle fazla değildir.

4. Elektroforez Yöntemleri: Aralarındaki başlıca fark destek ortamının tipi ve konumudur. Dikey yada yatay konumdaki destek ortamı sellüloz yada ince (poliakrilamid veya agaroz) jellerden hazırlanmış olabilir.

5. Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE): Akrilamidin polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamid jellerin elektroforetik ayırımlarda çeşitli üstünlükleri vardır. Küçük yada orta boydaki (1x106 Da’ya kadar) nukleik asitler ve proteinler için yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir.

6. Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrışmalarına yol açar çünkü ayrışım hem moleküler elekleme hem de elektroforetik harekete dayanır.

7. Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N’- metilen-bis-akrilamidin serbest radikal polimerizasyonu ile hazırlanır. Kimyasal polimerizasyon bir başlatıcı-katalizör sistemi (amonyum persülfat-TEMED) tarafından kontrol edilir.

8. Fotokimyasal polimerizasyon UV ışık altında riboflavin tarafından başlatılır. Proteinlerin ayrılması için kullanılan standart bir jel genelde % 7.5 poliakrilamid içerir.

9. Poliakrilamid jel elektroforezi çubuk (tüp) biçiminde veya düzlemsel (slab) biçiminde hazırlanmış jellerde gerçekleştirilir. Çubuk tipinde cam tüpler jel materyaliyle doldurulur; polimerizasyon 30-40 dakikada tamamlanır. Jel tüpü iki ayrı tampon deposu arasına yerleştirilir.

10. Üstteki depoda genellikle katod, alttakinde anod bulunur. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru hareket edeceklerinden jel elektroforezi genellikle bazik pH’da gerçekleştirilir.

12. Analiz edilecek örnek bir izleme boyası ile birlikte jelin tepesine uygulanır ve sistemden elektrik akımı geçirilir. Örnekteki bileşenlerden daha hızlı hareket eden izleme boyası jelin bitimine ulaştığında akım kesilir, jel tüpten çıkarılır ve boyanır. Tabaka jeller aynı anda çok sayıda örneğin aynı destek ortamında analiz edilmesine olanak vermeleri nedeniyle, kolonlara göre daha geniş çapta kullanılmaktadır. Polarizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak jelde küçük kuyucukların oluşumunu sağlar.

13. Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır, kuyucuklar tuzların ve polimerize olmamış akrilamidin uzaklaştırılması amacıyla tamponla yıkanır. Jel kaseti iki tampon deposu arasına yerleştirilir, kuyucuklara örnekler konur ve akım geçirilir. Poliakrilamid jel elektroforezi uygulamalarında bazı zorluklar vardır. Jellerin hazırlanmasında kullanılan akrilamid monomeri bir nörotoksindir ve kanser oluşturma tehlikesi olan bir maddedir, bu nedenle eldiven ile çalışılmalıdır.

14. Agaroz Jel Elektroforezi PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA molekülü parçalarının ayırımı için uygun değildir. 200-50.000 bç boyutları arasındaki DNA ve RNA moleküllerini tanımlamakta kullanılan standart yöntem destek ortam olarak agarozun kullanıldığı elektroforezdir.

15. Agaroz çözeltisi 50oC’a kadar soğutulduktan sonra jel kasetleri arasına veya jel tepsilerine dökülür. %0.5’den daha düşük agaroz içeren jeller çok kırılgan olduğundan yatay sistem tercih edilir. Nukleik asitlerin agaroz jeldeki hareketleri agaroz konsantrasyonu ile nukleik asit moleküllerinin boyutları ve şeklinden etkilenir. Nukleik asitlerin ayırımı için en etkin agaroz konsantrasyonları % 0.3-2.0’dir.

18. Agaroz jel elektroforeziyle özellikle değişik kökenli (kromozom, plazmid, organellere ait) DNA’ların izole edildikleri ve/veya restriksiyon enzimleriyle kesildikleri durumda molekül ağırlıkları ve miktarları belirlenebilir. Bu teknik, RNA’ya ait küçük (<500 nukleotid) parçaların ayrılması için kullanışlı bir sistem sağlar. Daha büyük (>500 nukleotid) tek zincirli parçaların ayrılması ve denatüre agaroz jellerin kullanımıyla yapılabilmektedir. Agaroz jel elektroforezi proteinlerin yüklerine göre ayrılmasında da kullanılmaktadır.

19. Değişken Alanlı (Pulsed Field) Jel Elektroforezi Değişken Alanlı Jel Elektroforezi (PEGE) ile büyük DNA molekülleri (maya kromozomlarının 200-300 kb boyutundaki DNA’ları) ayrılabilmektedir. PEGE’nin en belirgin farklı, uygulanan elektrik alanının sabit olmaması, ayırma sırasında yönün ve şiddetinin tekrarlanan biçimde değiştirilmesidir.

20. İzoelektrik Odaklama: Proteinlerin elektroforetik analizi için geliştirilmiş etkin bir teknik İzoelektrik Odaklama (isoelectric focusing, IEF) dir. Bir proteinin net yükü pH’ya bağımlıdır. Proteinler izoelektrik pH’larının (net yükün sıfır olduğu pH, pHI) altında pozitif olarak yüklüdürler ve sabit pH’lı bir ortamda negatif yüklü elektroda (katod) doğru göç ederler. İzoelektrik noktalarının üstündeki pH’da ise, protein proton kaybeder, negatif yüklü hale geçer ve pozitif yüklü (anod) doğru göç eder.

21. Elektroforez ortamının pH’sı proteinin pHI’sına eşitse, proteinin net yükü sıfır olacağından elektrodların hiçbirine doğru hareket etmez. Anoda bir asit (genellikle fosforik asit ), katoda da bir baz (trietanolamin) yerleştirilir.

23. Bir karışımdaki farklı protein molekülleri farklı pHI değerlerine sahip olacağından bunların IEF uygulamasıyla ayrılmaları mümkün olur. İki Boyutlu Elektroforez: SDS-PAGE ile proteinlerin ayrımının molekül boyutuna göre yapılmasına karşılık, IEF ile ayırım yüke dayanır. Bu iki yöntemin bileşimi olan iki boyutlu (2D) elektroforez, kompleks protein karışımlarının ayrışımında önemli ilerlemelere yol açmıştır.

24. İki farklı şekilde uygulanabilir; Ya önce IEF, daha sonra SDS-PAGE yapılır ya da “ISODALT” adı verilen sistem yardımıyla her ikiside aynı zamanda gerçekleştirilir. En yaygın olarak kullanılan O’Farrell sisteminde birinci boyutta iyonik olmayan deterjanlar ve üre varlığında, denatüre koşullarda çubuk jelde IEF gerçekleştirilir.

25. İkinci boyutta ise çubuk jel SDS-PAGE jeli üzerine uygulanır. Ayırım sonunda jel boyandığında tek bir jelde en az 1000 farklı proteinin görüntüsü elde edilebilmektedir.

28. Kılcal (Kapiler) Elektroforez: Yüksek ayrıştırma gücü ile HPLC’nin hız, çok yönlülük ve otomasyon özelliklerini birleştiren yeni bir tekniktir. Çok az miktardaki örneğin (5-10 μl), yüksek çözünürlükte ayrışımını ve attomol (10-18 mol) düzeyinde duyarlılıkla analizini sağlar.

29. Amino asitlerin, proteinlerin, nukleik asitlerin analizinde geniş çapta kullanılan bir tekniktir. Bir güç kaynağı, iki tampon deposu, tamponla doldurulmuş kılcal ir tüp (kolon) ve sürekli çalışan bir algılayıcıdan ibarettir.

30. Kılcal tüpler 50-100 μm çapında ce 25-100 cm boyunda esnek silikadan yapılmıştır. Güç kaynağına bağlanmış olan platin elektrodlar tampon depolarına daldırılır. Kılcal tüpe yüksek voltaj uygulanır ve az miktarda örnek solüsyon kılcal tüpün bir ucuna injeksiyon ile uygulanır.

31. Solüsyon içindeki moleküller elektrik alanının etkisi altında kılcal tüp boyunca hareket ederler. Tüpün diğer ucundan dışarı çıkan moleküller saptanır. Saptamada, ayrılan moleküllerin tipine göre değişir ama genel olarak UV-VIS dalga boylarında çalışan algılıyıcılardan yararlanılır.

33. En önemli üstünlüğü, HPLC gibi bir çok analitik deney tasarımına uygun olmasıdır. Immünoelektroforez: IE kompleks proteinlerin analizinde uygulanan ardışık iki işlem vardır.

34. 1) Karışımdaki proteinlerin agaroz jel elektroforeziyle ayrılması 2) Ayrılan proteinlerin antijenik özelliklerini belirlemek üzere özel antikorlarla etkileşime sokulmaları

36. KULLANIM ALANLARI • Saflaştırma • Saflık kontrolu • Molekül ağırlığı saptama • Kalıtsal veya kalıtsal olmayan hastalık saptama • Enzim izozimlerinin saptanması (tanısal amaçlı, populasyon çalışması için, adli tıpta) • İmmünolojik ve moleküler biyoloji

37. DİNLEDİĞİNİZ İÇİN TEŞEKKÜRLER ŞÜKRAN ELÇİN