Чвала Илья Александрович, зав. реф . лаб. вирусных болезней птиц, ФГБУ «ВНИИЗЖ»

1. Организация и проведение сличительных испытаний (грипп птиц, болезнь Ньюкасла), обзор результатов 2012-2013 гг. Чвала Илья Александрович, зав. реф. лаб. вирусных болезней птиц, ФГБУ «ВНИИЗЖ»

2. Нормативные документы • ГОСТ Р ИСО/МЭК 17025—2006 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий • ISO/IEC 17043:2010 “Conformity assessment—General requirements for proficiency testing,” «Оценка соответствия. Общие требования к проверке квалификации», • Межлабораторные сравнительные испытания при аккредитации и инспекционном контроле испытательных лабораторий. Методика и порядок проведения. Р 50.4.006-2002 • Правила организации проведения межлабораторных сличительных испытаний и профессионального тестирования специалистов учреждений, осуществляющих лабораторные исследования в области ветеринарии (утв. Федеральной службой по ветеринарному и фитосанитарному надзору 25 января 2010 г.)

3. Участие Референтной лаборатории вирусных болезней птиц в международных МСИ • Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie, Падуя, Италия (FAO/OIE референтная лаборатория), • DEFRA, Animal Health and Veterinary Laboratories Agency, Вэйбридж, Великобритания (OIE референтная лаборатория), • GD Animal Health Service, Дэвентер, Голландия, С учетом Laboratory Proficiency Testing (OIE) http://www.oie.int/en/our-scientific-expertise/reference -laboratories/proficiency-testing/

4. Задачи МСИLaboratory Proficiency Testing (OIE) • Оценка способности лабораторий проводить исследования с использованием конкретного метода/тест-системы, • Оценка достоверности исследований конкретного специалиста, • Проверка точности калибровки оборудования, • Оптимизация используемого или аппробация нового метода, • Приведение количественных результатов в соответствие (устранение межлабораторных отличий)

5. Программа МСИ • Стандартные условия исследования (в т.ч. методы, оборудование, диагностические тест-системы, и др.), • Количество проб для каждого из методов исследования (раундов), • Выбор штаммов для изготовления шифрованных проб, • Гарантия качества: однородность, активность и специфичность, стабильность, надлежащая маркировка и условия хранения/транспортировки, • Сбор и анализ результатов, • Оценка результатов (статистические методы?), • Корректирующие меры

6. Стандартные методы? • Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения от 30 июля 2009 г. N 02-03-48/563 • ГОСТ 25581-91 Птица сельскохозяйственная, синантропная, дикая и экзотическая. Методы лабораторной диагностики гриппа • ГОСТ 25587-83: Птица сельскохозяйственная. Методы лабораторной диагностики болезни Ньюкасла • Ветеринарные правила лабораторной диагностики гриппа А птиц (Приказ Минсельхоза России от 3 апреля 2006 года N 105) • Методические указания по лабораторной диагностике болезни Ньюкасла и классической чумы птиц (гриппа птиц) ГУВ МСХ СССР 1972 год • МУ по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации Департамент ветеринарии N 13-7-2/988 от 23.06.1997

7. Полимеразная цепная реакция • Тест-система для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР, НПО «Нарвак», • Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом ПЦР, НПО «Нарвак», • Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции «ГРИПП», вариант EPh, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва, • Тест-система для выявления и дифференциации вируса гриппа птиц методом полимеразной цепной реакции «ГРИПП» вариант FRT, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва, • Тест-система для обнаружения вируса гриппа А методом ПЦР, ООО «Ветбиохим», г. Москва, • Тест-система для обнаружения и дифференциации вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом ПЦР, ООО «Ветбиохим», г. Москва, в отдельных случаях наименования тест-систем приводились недостаточно полно, или без указания варианта проведения исследований (в режиме «реального времени» или ОТ-ПЦР).

8. Реакция торможения гемагглютинации • Набор для выявления антител к вирусу гриппа птиц подтипа Н5 в РТГА, ФГБУ «ВНИИЗЖ», • Набор для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни в РТГА, ФГБУ «ВНИИЗЖ», • Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в РТГА, ОАО «Покровский завод биопрепаратов», • Набор компонентов для выявления антител к вирусу ньюкаслской болезни птиц в РТГА, ООО «Кронвет», • Набор антигенов и сывороток для диагностики гриппа птиц в РТГА, ООО «Щелковский завод фармацевтических и ветеринарных препаратов». не все участники испытаний предоставили сведения по наименованиям и сериям использованных наборов

9. Оборудование

10. Laboratory Proficiency Testing (OIE):количество проб не менее 3/раунд 2013 год: ПЦР – 5 проб (антиген вируса гриппа различных подтипов, «нормальный» (отрицательный) антиген), РТГА – 4 сыворотки крови кур (гипериммунные сыворотки к вирусам гриппа и ньюкаслской болезни, нормальная (отрицательная) сыворотка)

13. Вирус ньюкаслской болезни

14. Результаты РТГА (Н5) с использованием референтных сывороток и антигенов, отечественных наборов Положительная сыворотка

15. A/mallard/Italy/3401/2005 H5N1 • A/turkey/Italy/1980 H5N2 • A/duck/Italy/775/2004 H5N3 • A/chicken/Italy/22A/1998 H5N9 • A/chicken/Italy/1067/1999 H7N1 • A/turkey/Italy/9289/2002 H7N3 • A/macaw/England/628/1980 H7N7

17. THE 2011-2012 WHO INFLUENZA REAGENT KIT FOR IDENTIFICATION OF INFLUENZA ISOLATES Produced and distributed by: WHO COLLABORATING CENTER FOR SURVEILLANCE, EPIDEMIOLOGY AND CONTROL OF INFLUENZA Located at: Centers for Disease Control and Prevention Influenza Division Virus Surveillance and Diagnosis Branch, G-16 1600 Clifton Road, NE Atlanta, Georgia 30333, U.S.A. Telephone: 404-639-3591 Fax: 404-639-0080 In Collaboration with Influenza Reagent Resource (IRR) and American Type Culture Collection (ATCC) http://www.influenzareagentresource.org

18. Технология изготовления шифрованных проб • Изученные штаммы, свободные от контаминации, • Получение высокоактивных, специфичных и стабильных образцов, • Проверка показателей с использованием различных методов и тест-системна всех этапах производства, сроках хранения • Объем проб: антигены по 1мл, сыворотки по 0,5мл, т.е. в количестве, достаточном для тестирования испытуемым методом, возможно исследование дополнительными методами

19. Анализ результатов - качественный Статистическая обработка данных не проводится ввиду: • использования тест-систем различных производителей (особенности наборов и реагентов), • особенностей методов РТГА и ПЦР (ОТ- или ОТ-реального времени), • уровень оснащенности лабораторий (использование оборудования различных производителей). Результат МСИ (для каждого образца): удовлетворительный, неудовлетворительный, сомнительный

20. Корректирующие меры • Стажировка специалистов лаборатории –участника МСИ в профильных лабораториях, • Расширение перечня применяемых тест-систем и методов, • Совместный анализ и устранение ошибок (организатор и участник)

21. Наиболее распространенные ошибки МСИ-2012 • ПЦР - техническая ошибка?, контаминация? • РТГА (идентификация антигена и выявление антител) – низкая активность положительных сывороток (от 1:16-1:32), использование единственного набора (без последующего подтверждения), неспецифическая реакция.

22. Рекомендации Участникам МСИ • Использование тест-систем нескольких производителей, • Использование дополнительных методов (РДП, ИФА, варианты ПЦР), • Проведение исследований параллельно несколькими специалистами, • Анализ полученных результатов до отправки организатору, • Подробный отчет о результатах исследований, с комментариями специалистов

23. Спасибо за внимание!e-mail: chvala@arriah.ru