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光谱扫描的重要性. Stokes’ 偏移. Stokes 偏移越大 , 越容易测量. 演示：一个红色荧光染料的检测波长优化. Ex/Em 大约在 ~650nm 附近， 微小的 Stokes 偏移. 微孔板的波长优化. 一 固定发射波长 Em ，扫描激发光波长 Ex 设定 Em 为高于预期波长 (700 nm) . 设定 Ex 的扫描，为了避免灯光的干扰，到离设定的 Em 10nm 处就停止 (600 – 690nm). 设置缓冲液空白对照. 激发波长扫描. 激发峰 ~ 650 nm. Sample. 灯光干扰. Blank.
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光谱扫描的重要性 Stokes’ 偏移 Stokes偏移越大, 越容易测量
演示：一个红色荧光染料的检测波长优化 Ex/Em大约在~650nm附近，微小的Stokes偏移
微孔板的波长优化 • 一 固定发射波长Em，扫描激发光波长Ex • 设定Em为高于预期波长 (700 nm). • 设定Ex 的扫描，为了避免灯光的干扰，到离设定的Em 10nm处就停止 (600 – 690nm). • 设置缓冲液空白对照
激发波长扫描 激发峰 ~ 650 nm Sample 灯光干扰 Blank
二 固定激发波长Ex，扫描发射光波长Em • 设定Ex 波长比Em最高峰低 20-30 nm(630 nm). • 为了避免灯光的干扰，设定Em扫描从比Ex波长 > 10 nm开始.(640 – 700nm).
微孔板发射波长扫描 发射峰 ~ 665 nm Sample 灯光干扰 Blank
微孔板波长优化：最终方案 • Ex/Em 最大峰 -- 650/665nm (小Stokes 偏移) • 必须用cutoff滤光片遮住入射灯光 • Cutoff滤光片的波长在 Ex 和 Em 波长之间 • Cutoff滤光片可以降低本底信号并能让发射光透过 • Cutoff滤光片可选择的范围区域630, 665 & 695nm. • 665 nm 滤光片最为合理因为它可以遮蔽入射灯光 • 必须增加 Ex/Em之间的分离把荧光从入射灯光中区分开来. • 降低 Ex 波长和增加 Em 波长 • 降低 Ex 波长到最大峰的 ~90% (645 nm) 并用665nm的cutoff滤光片，扫描Em波长. 出现最大的信号和最小的背景信号。
微孔板波长优化：最终扫描 最大发射 ~ 675 nm 灯光干扰 最低 背景从675 nm 开始低于1RFU 优化: Ex/Em = 645/675nm cutoff filter =665 nm
