DNS chip/ microarray

1. DNS chip/ microarray Egyszerre nagyszámú DNS (RNS) minta (komplex elegyek) analizálására szolgál. Alkalmazási területek: 1.) Génexpressziós mintázatok összehasonlítása (pl. fiatal/idős, nyugvó/stresszes, egészséges/beteg) 2.) Mutáns gének detektálása (pl. bizonyos betegségekre való hajlam) Alapelv: DNS hibridizáció A komplementer szálak összetapadnak

2. Kétféle DNS chip létezik 1.) Szintetikus DNS array/ GeneChip/ high-density oligonucleotide array Steve Fodor, Affymetrix Fotolitográfia segítségével in situ a chip felületén szintetizálják a DNS szálakat (pl. kombinatorikus kémiai módszerrel). Egy chip felszínén nagyszámú (105-106 db) mintapont található, amelyek rövid (20-30 bp) DNS molekulákat tartalmaznak. Egy mintapontban kb. 109 db DNS molekula van.

5. 2.) Klón chip/ spotted DNA microarray Robot segítségével a chip felületére klónozott DNS-t (genomiális vagy cDNS) rögzítünk. Előny: Olcsóbb mint a fotolitográfia és hosszabb DNS darabok (néhány száz bp) rögzíthetők. Hátrány: Kevesebb mintapont vihető fel (104 nagyságrend). De pl. egy élesztő genom (6000 gén) ráfér egy chippre!

6. Jelölés kétféle fluoreszcens fetékkel: Cy3 – vörös Cy5 – zöld Megvilágítás lézerrel, a fluoreszcens jel detektálása speciális chip leolvasó műszerrel. Jel: Az chip egyes pontjaiban a kétféle fluoreszcens fény intenzitása.

8. Proteomikai adatbankok létrehozása Egy adott élő szervezetben (sejtek, szövetek) található összes fehérjemolekula leltárba vétele. 1.) Sejtek feltárása 2.) Fehérjék szétválasztása két dimenziós (2D) elektroforézissel. 3.) Az egyes fehérjék azonosítása tömegspektrométerrel. A proteóma – hasonlóan a DNS csippel nyerhető génexpressziós adatokthoz – függ a körülményektől (pl. életkor, táplálékellátottság, sterssz, fertőzés, stb.).

9. 2D gélelektroforézis • Fehérjeminták hatékony szétválasztására szolgál. • dimenzió: Izoelektromos fókuszálás: töltés szerinti szétválasztás • dimenzió: SDS poliakrilamid gélelektroforézis: tömeg szerinti szétválasztás • A gélt érzékeny fluoreszcens festékkel festjük, a gélképet digitalizáljuk és a foltokat kivágjuk analízis céljából.

10. A 2D gélekből kivágott foltokból tömegspektometriával azonosítjuk a fehérjéket

11. Fehérjék szekvenálása Kémia módszerek: pl. Edman lebontás lassú (10 aminosav 24h), körülményes, csak rövid (max 30-40aa) szekvenciákat ad Tömegspektrometria: Elv: Megmérjük a fehérje molekulatömegét nagy pontossággal. Automatizálható, fehérjék gyors azonosítására alkalmas. Szekvenálni is lehet sorbakapcsolt tömegspektrométerekkel („szalámi taktika”). Mindazonáltal a fehérjeszekvenálás nehézkesebb, mint a DNS szekvenálás és az MS teljesen nem tudja kiváltani a kémiai módszereket.

12. A fehérjéket felépítő aminosavak

13. Tömegspektrometria (MS) Rövid polipeptidszakaszok (20-30 aa) gyors (néhány perc) szekvenálására szolgál. Minimális az anyagszükséglet (0.5-1 pmol). 6-8 aminosav hosszú szekvencia már általában egyértelműen azonosítja a fehérjét. A rövid szekvencia birtokában a gén azonosítása (klónozása) is lehetséges. A vizsgálandó molekulát gázfázisba kell juttatni és ionizálni kell vákuumban A molekulaiont elektromos/mágnenses térbe helyezve az útja (pl. repülési idő TOF) a tömeg/töltés (m/z) aránytól függ. Ebből meghatározható a molekulatömeg (M) nagy pontossággal. Probléma: A makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak) gázfázisba juttatása sokáig nem volt lehetséges a molekulák lebomlása nélkül.

14. Fehérjék gázfázisba juttatása 1.) Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI MS). A fehérjét fényelnyelő hordozóanyaggal keverjük és vákuumban lézer fénnyel megvilágítjuk. 2.) Elektronspray ionization mass spectrometry (ESI MS). A fehérje oldatot egy elektromosan töltött tűn keresztül porlasztjuk a vákuumba. A gázfázisban a fehérjét körülvevő víz elpárolog és visszamarad a többszörösen töltött molekulaion. A töltés általában protonoktól származik. Sok különbözően töltött molekula keletkezik (különböző számú protont kötnek). A spektrumban az egymáshoz közeli csúcsok egy proton tömegében és töltésében különböznek. (m/z)2 = (M+n2X)/n2 n2: töltések száma (m/z)1 = (M+(n2+1)X)/n2+1 X: a töltés (proton) tömege Két ismeretlen (M, n2), két egyenlet. Bármely szomszédos csúcspárra ki tudjuk számolni M-et átlag igen nagy pontosság

15. MALDI MS

16. ESI MS

17. Fehérje szekvenálás tandem MS (MS/MS)-sel Fehérje minta proteáz peptidek MS1 Collision cell fragmentek MS2 detektor He, Ar A fragmentumok egy aminosavban különböznek egymástól. A szekvencia leolvasható. Bizonytalanság: Leu vs. Ile teljesen egyeznek Gln vs. Lys 128.13/128.17 két Gly (2X57) vs Asn (114)

18. DNS adatbázisok fajtái 1.) Genomiális DNS adatbázisok Szekvenciák minősége nagyon fontos szempont. Jó minőségű szekvenciához mindkét DNS szálat többször le kell olvasni. Időigényes és drága folyamat. Van amikor nincs szükség nagy pontosságra: Single-pass sequencing Rövid (200-300 bp) DNS szálak (csak az egyik szál) gyors szekvenálása Gyors, olcsó, de kis pontosságú. GSSs≡ genome survey sequences STS ≡ sequence tagged site Egyedi genomiális szekvenciák, amelyek markerként használhatók. HTG ≡ high-throughput genomic sequence Befejezetlen genom szekvenciák

19. 2.) cDNS adatbázisok EST ≡ expressed sequence tag cDNS molekulák single-pass szekvenálása Alkalmas gének azonosítására és cDNS chippek tervezésére 3.) Élőlény specifikus adatbázisok: (pl. Gold (fizetős)) Pl. E. coli Élesztő Arabidopsis (lúdfű) Egér Ember

20. SNP ≡ Single-nucleotid polimorphism SNP (kiejtés: sznip) Egy bázis eltérés a genomban két egyed között (pontmutáció). Szubsztitúció, inszerció, deléció Az emberi genomban átlag minden 5000. bázis SNP. Jelenleg kb. 1,8 millió SNP-t ismerünk. Példák: Sarlósejtes vérszegénység A T mutáció GAG GTG Glu Val Súlyos betegség, de véd a malária ellen. A, B, 0 vércsoport marker: 4 SNP különbség

21. SNP-k a genom egész hosszában vannak, de a génekben gyakoribbak. Egy adott egyén genotípusát jól jellemzik az SNP-i (SNP pattern). SNP-k sokszor csendes mutációk, máskor Stop kódon keletkezik vagy tűnik el. Legfontosabb gyakorlati alkalmazások: Betegségekre való hajlam kimutatása: Association study: Egészséges és beteg emberek SNP mintázatának összehasonlítása Betegségre hajlamosító SNP-k kiszűrése Farmakogenomika: Egyes hatóanyagok felszívódására, lebomlására, kiürülésére jellemző SNP-k Cél: személyre szabott terápia SNP mintázat alapján.

22. Fehérje adatbázisok 1.) Fehérje szekvenciák SWISS-PROT, TrEMBL Aminosav szekvenciák bőséges annotációval. 2.) Fehérje térszerkezetek PDB ≡ Protein Data Bank Atomi koordináták annotációval. 3.) Funkcionális, kölcsönhatási adatbázisok PIR ≡ Protein Information Resource DIP ≡ Database for Interacting Proteins A fehérjék sejtben betöltött szerepéről, kölcsönhatási hálózatokról tájékoztatnak.

23. Speciális adatbázisok 1.) Fehérjéket felépítő domének Pfam ≡ Protein Families Smart ≡ Simple Modular Architecture Research Tool CCP module database 2.) Speciális funkcióval rendelkező fehérjék Merops (proteázok adatai) 3.) Betegségek genetikai háttere OMIM ≡ Online Mendelian Inheritance in Man 4.) Irodalmi adatbázisok Medline, Science Direct

24. Bioinformatika a gyógyszerkutatásban A gyógyszermolekula (drug) kölcsönhat a célfehérjével (target), aminek az eredménye egy biológiai/fiziológiai hatás lesz. A mai gyógyszerkutatás target központú, ezért egyre inkább támaszkodik a bioinformatikára és a rokon tudományokra (genomika, proteomika, kombinatorikus kémia, HTS). Target keresés és validálás: 1.) Célfehérjék keresése a humán genomban 2.) Target keresés a patogén mikroorganizmusokban Gyógyszerjelölt molekulák (lead compound) keresése Dokkolás, in silico screening, (rational drug design) Vegyületek optimalizálása Gyógyszerhatás Farmakogenomika, személyre szabott gyógyszerezés