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Metodi Spettroscopici in Biochimica Principi e Applicazioni R. Zanasi

Metodi Spettroscopici in Biochimica Principi e Applicazioni R. Zanasi Dipartimento di Chimica e Biologia.

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Metodi Spettroscopici in Biochimica Principi e Applicazioni R. Zanasi

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  1. Metodi Spettroscopici in Biochimica Principi e Applicazioni R. Zanasi Dipartimento di Chimica e Biologia

  2. L’assorbimento e l’emissione di radiazione elettromagnetica da parte della materia sono processi molto importanti, non solo per lo studio dei sistemi biologici, ma anche per le funzioni della vita così come la conosciamo. Chemical structure of beta-carotene. The eleven conjugated double bonds that form the chromophore of the molecule are highlighted in red.

  3. Senza l’interazione tra luce e cromofori non ci sarebbe percezione visiva e le piante non sarebbero in grado di eseguire la fotosintesi per produrre zuccheri e altri carboidrati. Structureofchlorophylla

  4. Nello studio delle strutture biologiche l’interazione tra radiazione e materia non è limitata alla sola regione visibile dello spettro elettromagnetico. In spettroscopia biologica, radiazione di lunghezza d’onda variabile in ordine di grandezza tra km e nm è stata impiegata con successo. ESR NMR

  5. Ci sono molte sorgenti di radiazione. Per esempio, la radiazione visibile (“Luce”) è generata da reazioni chimiche e trasformazioni di energia nella fiamma che si produce bruciando sostanze di vario tipo. Nel sole, la “luce diurna” è generata dalla fusione nucleare di H in He, durante la quale un largo intervallo di radiazione è emesso che si estende ben oltre la regione visibile. Fortunatamente, l’atmosfera assorbe la maggior parte della luce ad alta energia, come la radiazione ultravioletta (UV) che è pericolosa per la vita sul nostro pianeta. Radiazione elettromagnetica è generata da scariche elettriche come, ad esempio, fulmini, tubi al neon, ecc.. Radiazione è generata anche da circuiti elettrici, per esempio radio, televisione, cellulari, ecc..

  6. Anche certi animali sono capaci di generare radiazione elettromagnetica. Esempi sono alcuni tipi di meduse e le lucciole. La medusa luminescente (aequorea victoria) è capace di produrre lampi di luce blu (469 nm).

  7. I lampi di luce blu sono prodotti da un incremento intracellulare di [Ca2+] che causa la transizione Aequorin + 3Ca2+  Apoaequorin + CO2 + hv (469 nm) + coelenteramide Apoaequirin + coelenterazine + O2 Aequorin Mechanism of Action The two components of aequorin reconstitute spontaneously, forming the functional protein. The protein bears three binding sites for Ca2+ ions. When Ca2+ occupies such sites, the protein undergoes a conformational change and converts through oxidation its prosthetic group, coelenterazine, into excited coelenteramide and CO2. As the excited coelenteramide relaxes to the ground state, blue light (wavelength = 469 nm) is emitted. AequorinribbondiagramfromPDB (Protein Data Bank) database withprostheticgroupcoelenterazine in blue

  8. La luce blu è quindi trasdotta a verde (502 nm) dalla famosa green fluorescentprotein (GFP) GFP ribbon diagram. From PDB

  9. In 1961, Osamu Shimomura of Princeton University extracted green fluorescent protein (GFP) and another bioluminescent protein, called aequorin, from the large and abundant hydromedusa Aequoreavictoria, while studying photoproteins that cause bioluminescence by this species of jellyfish. Three decades later, Douglas Prasher, a post-doctoral scientist at Woods Hole Oceanographic Institution, sequenced and cloned the gene for GFP. Martin Chalfie of Columbia University soon figured out how to use GFP as a fluorescent marker of genes inserted into other cells or organisms. Roger Tsien of University of California, San Diego, later chemically manipulated GFP in order to get other colors of fluorescence to use as markers. In 2008, Shimomura, Chalfie, and Tsien won the Nobel Prize in Chemistry for their work with GFP. Man-made GFP is now commonly used as a fluorescent tag to show which cells or tissues express specific genes. The genetic engineering technique fuses the gene of interest to the GFP gene. The fused DNA is then put into a cell, to generate either a cell line or (via IVF techniques) an entire animal bearing the gene. In the cell or animal, the artificial gene turns on in the same tissues and the same time as the normal gene. But instead of making the normal protein, the gene makes GFP. One can then find out what tissues express that protein —or at what stage of development—by shining light on the animal or cell and observing fluorescence. The fluorescence shows where the gene is expressed.

  10. The Nobel Prize in Chemistry 2008 was awarded jointly to Osamu Shimomura, Martin Chalfie and Roger Y. Tsien"for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP".

  11. La radiazione è caratterizzata da una lunghezza d’onda, un’ampiezza e velocità di propagazione. Energia, frequenza, lunghezza d’onda e numeri d’onda sono dati dalle seguenti equazioni Costante di Planck Velocità della luce nel vuoto Numeri d’onda in cm-1 L’onda elettromagnetica è descritta come

  12. Electromagnetic waves can be imagined as a self-propagating transverse oscillating wave of electric and magnetic fields. This diagram shows a plane linearly polarized wave propagating from left to right. The electric field is in a vertical plane and the magnetic field in a horizontal plane

  13. Una tipica modalità spettroscopica è quella di mandare radiazione attraverso un campione, continuamente o a impulsi. In funzione del tipo di radiazione le molecole del campione reagiscono alla perturbazione elettromagnetica mediante una alterata distribuzione delle cariche e degli spin molecolari. Occorre spigare: perché solo un certo tipo di radiazione è assorbita; quanto velocemente le molecole reagiscono alla perturbazione; quanta materia viene alterata dalla radiazione. Introduciamo una descrizione qualitativa dell’interazione radiazione/materia percorrendo le varie regioni spettrali che sono individuate dal tipo di risposta molecolare alla perturbazione.

  14. Regione delle radio frequenze (rf): si estende dal MHz (km) a circa 50 GHz (cm). Queste frequenze sono usate in spettroscopie di risonanza magnetica nucleare (NMR, MHz) e in spettroscopia di risonanza paramagnetica elettronica (EPR, anche chiamata spettroscopia di risonanza di spin elettronico, ESR, GHz). L’assorbimento di energia radiante provoca il ribaltamento degli spin nucleari o elettronici ed è dell’ordine di 0.001-20 J/mol. Allo spin è associato un piccolo dipolo magnetico e il ribaltamento dello spin risulta dalla interazione di questo dipolo con il campo magnetico della radiazione ad una frequenza appropriata.

  15. All isotopes that contain an odd number of protons and/or of neutrons have an intrinsic magnetic moment, in other words a nonzero spin, while all nuclides with even numbers of both have a total spin of zero. The most commonly studied nuclei are 1H and 13C, although nuclei from isotopes of many other elements (e.g. 2H, 6Li, 10B, 11B, 14N, 15N, 17O, 19F, 23Na, 29Si, 31P, 35Cl, 113Cd, 129Xe, 195Pt) have been studied by high-field NMR spectroscopy as well.

  16. Regione delle microonde: 30 GHz (1cm) - 3000GHz (0.1mm). Queste frequenze sono usate in spettroscopie rotazionale. In questo tipo di spettroscopia, solo le molecole che possiedono un momento di dipolo elettrico permanente (polari) possono interagire con la radiazione elettromagnetica. L’energia rotazionale molecolare è quantizzata. Pertanto solo le frequenze corrispondenti alla differenza di energia tra due livelli rotazionali possono essere assorbite. Questa separazione è dell’ordine di 100 J/mol. L’assorbimento di energia radiante provoca una diversa distribuzione della popolazione dei livelli rotazionali. Molecole attive: H2O, HCl, HCN, CO,… Molecole non attive: H2, O2, C6H6, CH4, CO2, Cl2,…

  17. Regione infrarossa (IR): 3x1012 Hz (0.1mm) – 3x1014 Hz (1m). Queste frequenze sono usate in spettroscopie vibrazionale. La spettroscopia vibrazionale è particolarmente utile in chimica e biochimica. La separazione tra i livelli di energia vibrazionale molecolari è dell’ordine di 10 kJ/mol. L’assorbimento di radiazione provoca una diversa distribuzione di carica. Pertanto, solo i moti vibrazionali che comportano una variazione del momento di dipolo elettrico molecolare possono interagire con la radiazione. Prendiamo il caso del biossido di carbonio ad esempio

  18. Nella vibrazione “stretching simmetrico” la molecola di CO2 è alternativamente allungata e compressa, entrambi i legami vibrano simultaneamente (simmetricamente) e il momento di dipolo non cambia. Questo particolare moto vibrazionale non è arrivo in IR.

  19. Regione visibile e ultravioletto (UV-Vis): 3x1014 Hz (1m) – 3x1016 Hz (10nm). Queste frequenze sono usate in spettroscopie elettronica. La separazione tra i livelli di energia degli elettroni di valenza è dell’ordine di 100 kJ/mol. Le transizioni elettroniche comportano una ridistribuzione di carica e, pertanto, a una variazione del momento di dipolo elettrico molecolare, provocato dall’interazione con il campo elettrico della radiazione.

  20. Regione dei raggi X: 3x1016 Hz (10nm) – 3x1018 Hz (100pm). Queste frequenze provocano transizioni degli elettroni interni. La separazione tra i livelli di energia degli elettroni interni è dell’ordine di 10000 kJ/mol. Regione dei raggi : 3x1018 Hz (100pm) – 3x1020 Hz (1pm). Queste frequenze provocano transizioni coinvolgenti particelle nucleari. L’energia assorbita è dell’ordine di 109-1010 J/mol.

  21. Tryptophan Tyrosine Phenylalanine

  22. Spettroscopia Infrarossa (IR) La spettroscopia infrarossa è una spettroscopia tipicamente di assorbimento che interessa la regione a lunghezza d’onda maggiore (frequenza ed energia minore) rispetto alla luce visibile (1-100 1m). L’energia della luce infrarossa non è sufficiente a indurre transizioni degli elettroni di valenza. La radiazione infrarossa eccita moti vibrazionali e rotazionali nelle molecole. I principi della spettroscopia infrarossa sono gli stessi della spettroscopia UV-Vis. Tuttavia, gli spettri infrarossi presentano usualmente il grafico della trasmittanza percentuale in funzione del numero d’onda in cm-1. Un tipico spettro IR copre da 4000-10000 cm-1 (limite superiore) a 100-800 cm-1 (limite inferiore).

  23. Le transizioni vibrazionali molecolari avvengono fra livelli di energia vibrazionale distinti. La più semplice situazione possibile è la vibrazione di due atomi in una molecola biatomica. La distanza tra i due atomi varia continuamente e la distanza internucleare media definisce la distanza di legame. Se assumiamo che il legame tra i due atomi sia comparabile a una molla tra due sfere di massa m1 e m2 e che la forza di compressione o espansione sia data dalla legge di Hook, abbiamo il cosiddetto modello dell’oscillatore armonico. (Notare che la forza si oppone allo spostamento degli atomi.)

  24. L’energia potenziale classica dell’oscillatore armonico aumenta simmetricamente quando la distanza tra gli atomi varia. Il suo valore dipende dall’ampiezza del moto che classicamente può essere qualsiasi. La vibrazione di una tale molecola diatomica è caratterizzata da una frequenza di oscillazione che è data dalla meccanica classica: dove m è la massa ridotta del sistema: 2r0Ep/k r/r0 La frequenza di oscillazione non dipende dall’ampiezza dell’oscillazione.

  25. In contrasto alla meccanica classica, l’energia vibrazionale delle molecole è quantizzata (come ogni altra energia molecolare). I livelli di energia vibrazionale permessi sono Dove v è il numero quantico vibrazionale e n è la frequenza di vibrazionale classica. Il numero quantico vibrazionale può assumere i valori 0,1,2,3,… ciò implica che il più basso valore di energia non è nullo (gli atomi vibrano sempre, anche allo zero assoluto). La quantità è nota come energia di punto zero.

  26. Un ulteriore risultato che si ottiene applicando il trattamento quantistico al modello dell’oscillatore armonico è la semplice regola di selezione Riassumendo: 1) durante il moto vibrazionale il momento di dipolo elettrico della molecola deve cambiare; 2) sono permesse solo transizioni tra livelli di energia adiacenti.

  27. L’energia della transizione è data da: Ciò significa che per l’oscillatore armonico i livelli di energia vibrazionale sono equidistanti, indipendentemente dal numero quantico vibrazionale . Quando la frequenza della radiazione è identica a quella della vibrazione, si ha risonanza: la radiazione viene assorbita causando la transizione vibrazionale, sempre nel caso in cui il momento di dipolo elettrico della molecola cambi durante il moto vibrazionale. L’intensità complessiva dell’assorbimento dipende dall’intensità della radiazione (densità di radiazione, quantità di fotoni) e dal numero di molecole in grado di compiere la transizione vibrazionale (vedi legge di Bouguer-Beer-Lambert)

  28. Il modello dell’oscillatore armonico descrive abbastanza bene il comportamento reale. Tuttavia, le molecole non si comportano esattamente come masse connesse da una molla, in quanto i legami chimici: sono sì elastici, ma non obbediscono alla legge di Hook; si rompono se allungati oltre un certo limite e la molecola dissocia; non possono essere accorciati fino a far sovrapporre i nuclei, i quali si respingono fortemente se avvicinati. Questo comportamento è descritto in modo più accurato dalla funzione di Morse, che è un’approssimazione migliore del potenziale dell’oscillatore armonico.

  29. La costante di anarmonicitàx è piccola e positiva. I livelli di energia vibrazionale non sono più equidistanti, ma si avvicinano sempre più aumentando il numero quantico vibrazionale Dove a è una costante che dipende dal legame e DMin è l’energia di dissociazione del legame stesso.

  30. Le regole di selezione per l’oscillatore anarmonico sono Comunque, l’intensità degli assorbimenti diminuisce fortemente aumentando il salto energetico, al punto che transizioni sono raramente osservate.

  31. Nel caso di molecola poliatomiche si ha più di un legame chimico. Inoltre, ci sono altri gradi di libertà vibrazionali. Una molecola con N atomi può essere descritta localizzando ogni atomo nello spazio mediante tre coordinate x,y,z, per un totale di 3N coordinate o gradi di libertà totali. La traslazione della molecola tutta assieme rigidamente (tutti gli atomi nella stessa direzione per un uguale spostamento) richiede 3 coordinate del centro di massa (3 gradi di libertà non vibrazionali). Allo stesso modo, la rotazione della molecola rigida attorno al centro di massa richiede 3 assi di rotazione, ovvero altri 3 gradi di libertà non vibrazionali (2 nel caso di molecole lineari). Pertanto restano: 3N-6(molecole non lineari ) H2O GLV=3 3N-5 (molecole lineari) CO2 GLV=4 gradi di libertà vibrazionali

  32. Ad ogni grado di libertà vibrazionale corrisponde un modo di vibrare della molecola detto fondamentale o normale. I modi normali di vibrazione sono classificati come simmetrici o antisimmetrici se la simmetria della molecola è mantenuta o no durante la vibrazione.

  33. Un altro risultato molto importante della meccanica quantistica, di carattere generale, descrive come una molecola che si trova in un determinato livello energetico possa assorbire o emettere radiazione. Si dice emissione stimolata il fenomeno quantistico per cui la radiazione elettromagnetica, oltre che ad eccitare un sistema, può anche stimolarne la diseccitazione. Se si applica la teoria delle perturbazioni dipendente dal tempo si ottiene infatti che la probabilità di transizione fra due livelli è pari al 100% quando l‘energia della radiazione incidente è pari alla differenza di energia fra i due livelli. Se il sistema si trovava nel livello inferiore si ha un fenomeno di assorbimento risonante della radiazione, ovvero l‘onda viene assorbita ed il sistema si eccita al livello superiore. Se, al contrario, il sistema era già eccitato si disecciterà emettendo radiazione elettromagnetica alla stessa frequenza, e nella stessa direzione, di quella incidente. Questo fenomeno è alla base del funzionamento dei laser e dei maser. A laser is a device that emits light (electromagnetic radiation) through a process of optical amplification based on the stimulated emission of photons. The term "laser" originated as an acronym for Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation.

  34. Questo significa che l’assorbimento viene parzialmente compensato dalle molecole già eccitate. Per una data transizione, l’intensità di assorbimento risulta quindi proporzionale alla differenza tra il numero di particelle nel livello inferiore e il numero di particelle nel livello superiore. Il rapporto tra le popolazioni è dato dalla legge di distribuzione di Boltzmann

  35. Nel caso della spettroscopia IR, nell’intervallo tipico di numeri d’onda 500-4000 cm-1, la maggior parte delle molecole a temperatura ambiente popolano il livello di energia vibrazionale più basso. Lo spettro IR è quindi dominato da assorbimenti di radiazione che provocano transizioni vibrazionali 0  1 (fondamentali). Altri assorbimenti più deboli possono essere notati per transizioni vibrazionali 0  2, 0  3, … (sovratono, overtone). In ogni caso, il momento di dipolo elettrico della molecola deve variare durante il moto vibrazionale. Le transizioni vibrazionali si possono combinare. In questo caso l’assorbimento avviene a una frequenza pari alla somma delle frequenze dei modi individuali. E’ sufficiente che un solo modo vibrazionale provochi la variazione del momento di dipolo elettrico della molecola affinché l’assorbimento combinato sia attivo. esempi

  36. Che tipo di informazione può essere ottenuta dalla spettroscopia IR eseguita su campioni biologici? Una delle principali applicazioni della spettroscopia IR in biologia riguarda l’identificazione della struttura secondaria delle proteine. I gruppi di atomi in una sequenza poli-peptidica di una proteina vibrano diversamente se la struttura secondaria è di tipo alfa elica (a-helix) o foglietto beta (b-sheet). Questi motivi strutturali vennero correttamente predetti da Pauling e Corey usando considerazioni teoriche ancora prima della loro effettiva determinazione sperimentalmente.

  37. Proc. N.A.S.1951,37, 205 Linus Pauling and Robert Corey examining models of protein structure molecules. approx. 1951.

  38. Julian Voss-Andreae'sAlpha Helix for Linus Pauling (2004), powder coated steel, height 10 ft (3 m). The sculpture stands in front of Pauling's childhood home on 3945 SE Hawthorne Boulevard in Portland, Oregon, USA.

  39. Un vantaggio delle tecniche spettroscopiche rispetto alla cristallografia a raggi x, che richiede cristalli di proteina allo stato solido, è che queste tecniche possono essere usate per determinare gli elementi strutturali delle proteine in soluzione acquosa. Questi metodi sono molto utili perché permettono di chiarire velocemente la struttura secondaria di una proteina e di determinare se ci sono variazioni strutturali in seguito all’interazione con altre molecole. Inoltre, la moderna spettroscopia IR consente esperimenti risolti nel tempo (timeresolved) per monitorare i cambiamenti di folding delle proteine e nello studio della funzione delle proteine. La spettroscopia IR può essere applicata a proteine molto grandi, a differenza della spettroscopia NMR.

  40. Nelle a eliche lo scheletro del polipeptide risulta strettamente arrotolato attorno a un asse centrale immaginario, mentre i gruppi laterali degli amminoacidi sporgono radialmente all'esterno dell'elica. L’ a elica è stabilizzata da legami idrogeno tra i gruppi NH e CO della catena centrale. Il gruppo CO di ogni amminoacido è legato al gruppo NH dell’amminoacido che è quattro residui più avanti nella sequenza lineare, così che tutti i gruppi CO e NH della catena principale sono legati fra loro mediante legami idrogeno. 3.6 residui formano un giro completo. L’angolo tra due amminoacidi è di 100 a la loro distanza proiettata sull’asse dell’elica è 1.5 Å, corrispondente a uno spostamento di 5.4 Å per giro completo. ahelix

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