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不同生物的复制体系

不同生物的复制体系. 功能 E.coli λ SV40/ 人 酵母 起始蛋白 DnaA O T 抗原 ORC 解旋酶 DnaB DnaB T 抗原 MCM

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不同生物的复制体系

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Presentation Transcript

  1. 不同生物的复制体系 功能 E.coliλ SV40/人 酵母 起始蛋白 DnaA O T抗原 ORC 解旋酶 DnaB DnaB T抗原 MCM 装配因子 DnaC P T抗原？ Cdc6 引发酶 DnaG DnaG Polα-引发酶 Polα-引发酶 聚合酶 PolⅢ的α亚基 Polδ Polδ,Polε 校正 PolⅢ的ε亚基 Polδ Polδ,Polε 滑动钳 PolⅢ的亚基 PCNA PCNA 滑动钳装配器  复合体 RF-C RF-C 单链结合蛋白 SSB RF-A RF-A

  2. 原核生物和真核生物DNA复制的比较 相同点： 1）半保留复制方式 2）半不连续复制 3）DNA 螺旋酶, SSBP 4）RNA 引物 不同点： 1） 复制起点（单、多） 2）复制子（大小、多少） 3）复制叉移动的速度 4）冈崎片段的大小 5）端粒和端粒酶 6）DNA聚合酶

  3. 复制子的大小 : 酵母 平均 40 kb 脯乳动物 平均 100 kb 原核生物 >1000 kb 冈崎片段 原核生物 1000-2000 nt 真核生物 100-200 nt 复制速度 原核生物50,000bp/min (750/sec) 真核生物 3,000bp/min (50/sec) DNA聚合酶 真核生物 五种，α、β、γ、δ和ε 原核生物 三种 ，polⅠ、Ⅱ、Ⅲ 引物酶作用特点 真核细胞 DNA引物酶和polα紧密偶联， 原核细胞 引发酶和解旋酶偶联，形成复制体的一部分。

  4. RNA合成的基本特征： • 5’→3’方向； • 底物三磷酸核苷酸（NTP） • 不对称转录，以单链DNA为模板。 • 不需要引物，合成是连续的。 • 对一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，且每个基因的转录都受到相对独立的控制。

  5. 大肠杆菌RNA聚合酶的组成

  6. 真核生物的RNA聚合酶

  7. 典型原核生物启动子的结构 原核生物启动子的结构特点 -35 -10 转录起点 TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp

  8. I 型： II 型 III型 －170 －160 －150 －140 －130 －120 －110………..－60 －50 －40 －30 －20 －10 ＋1 ＋10 ＋20 上游控制区 核心启动子 真核生物 RNA pol 启动子

  9. 原核生物转录初始的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物 因为： (1) 5’端都是单磷酸，而原始的转录产物5’三磷酸； (2) 分子比初始转录物小； (3) tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。

  10. 真核mRNA的加工和成熟 5’加帽 3’加尾 特殊碱基的修饰 内含子的切除

  11. 第五章 转录

  12. 转录（transcription）：以DNA为模板合成RNA的过程。转录（transcription）：以DNA为模板合成RNA的过程。 • 转录所需的酶叫做依赖DNA的RNA聚合酶。 • 转录产生初级转录物为RNA前体（RNA precursor），必须经过加工过程变为成熟的RNA。

  13. 模板链, 无意义链：在DNA的两条多苷酸链中只有其中一条链作为模板。 • 编码链，有意义链: DNA双链中另一条不做为模板的链； • 不对称转录：RNA的转录合成是以DNA的一条链为模板而进行的。

  14. 第一节 转录酶 • 第二节 启动子 • 第三节 终止子 • 第四节 转录的机制 • 第五节 转录产物的后加工 • 第六节 RNA的剪接

  15. 第一节 转录酶1 原核生物的RNA聚合酶2 真核生物的RNA聚合酶

  16. RNA合成的基本特征： • 5’→3’方向； • 底物三磷酸核苷酸（NTP） • 不对称转录，以单链DNA为模板。 • 不需要引物，合成是连续的。 • 对一个基因组来说，转录只发生在一部分基因，且每个基因的转录都受到相对独立的控制。

  17. 1 原核生物的RNA聚合酶（RNA polynerase） 1.1 RNA pol与DNA pol作用的相同点： DNA模板，Mg2＋，4种三磷酸核苷。 • 不同点： （1）RNA pol没有任何校对功能； （2）能起始新的RNA链。

  18. 1.2组成 • 大肠杆菌RNA聚合酶由多亚基组成， α2ββ’ωσ称为全酶, 480 KDa • 亚基与全酶结合疏松，很容易与全酶分离。

  19. 1.3 各亚基的功能 β亚基：由rpoB编码，结合底物（NTP及新生RNA链），进行聚合作用。 β′亚基：由rpoC编码，可能与模板结合。 α亚基：由rpoA编码，可能参与全酶的组装及全酶识别启动子，还参与RNA聚合酶与一些调控因子间的作用。 ω 亚基：约10KD,作为核心酶，具体功能不清楚。 σ亚基/因子：使全酶识别启动子并与之结合，也看作一种辅助因子。

  20. 1.4 σ亚基/因子 • σ因子在RNA聚合酶识别启动子的过程中起关键作用，σ因子可重复使用。 • 不同的因子可识别不同的启动子

  21. 因子更替的现象 • 在细菌受到外界环境的急剧影响时，会改变所表达的基因，产生因子更替的现象。 • 如环境温度升高时，大肠杆菌会开启rpoH基因的表达， 其产物32能识别热激基因的启动子，而正常状态下表达的基因会关闭或表达水平下降。 • 芽孢菌生活周期过程中生活方式的改变也是通过因子的更替完成的。

  22. 第一节 转录酶1 原核生物的RNA聚合酶2 真核生物的RNA聚合酶

  23. 2 真核生物的RNA聚合酶

  24. 某些常用的转录抑制剂

  25. 2.1 真核RNA聚合酶的结构特点： 1）大分子蛋白质，500KDa或更多； 2) 分子量500KDa, 含两个大亚基和 7~12 个小亚基。 RNApolⅡ： 3) 大亚基中有 羧端功能区(carboxy terminal domain CTD) CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复 Tyr－Ser－Pro－Thr－Ser－Pro－Ser C 端重复七肽 不同生物中重复数目不一样（酶活性）

  26. CTD： • 参与转录起始 • 真核RNA pol独有。 • CTD参与转录 → ⅡB → ⅡA → 使 RNApol易于离开启动子进入延伸过程（10倍）

  27. 2.2 线粒体和叶绿体的RNA pol • RNA pol较小，更类似于细菌的RNA pol。 • RNA pol转录控制也很简单，只转录少数几个基因 。

  28. 第一节 转录酶 • 第二节 启动子 • 第三节 终止子 • 第四节 转录的机制 • 第五节 转录产物的后加工 • 第六节 RNA的剪接

  29. 第二节 启动子 1 原核生物的启动子 2 真核生物的启动子

  30. 1 原核生物的启动子 启动子（promoter）：DNA分子与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是转录开始的部位。 • 不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同， • 根据其合成蛋白质的多少区别为强弱启动子。 • 强启动子与RNA聚合酶亲和性高，合成的mRNA多，翻译的蛋白质也多。

  31. －10 ＋1 ＋10 upstream start point downstream • DNA上开始转录的第一个碱基定为+1， • 沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示； • 逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。

  32. 典型原核生物启动子的结构 1.1 原核生物启动子的结构特点 -35 -10 转录起点 TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp

  33. 1） 转录起始点 1.1 原核生物启动子的结构特点 • 多数情况下（>90%）为嘌呤， • 常见序列为CAT，A为起始点

  34. 2） -10区 又称为Pribnow盒 • 结构特点： • 保守序列：TATAAT（T80A95T45A60A50T96） • A.T较丰富，易于解链。 • 功能： (1) RNA pol结合位点 ； (2) 形成开放启动复合体； (3) 使RNA pol定向转录。

  35. 3） -35区 又称为Sextama box 结构特点： • 其保守序列 TTGACA（T82T84G78A65C54A45） • 与-10序列，相隔16-19bp。 功能： • (1) 为RNA pol的识别位点。 • σ亚基识别-35序列，为转录选择模板链。 • RNA Pol 核心酶和模板结合，进行聚合； (2) 很大程度上决定了启动子的强度。

  36. －35 序列与－10 序列与转录效率的关系 标准启动子 －35 TTGACA －10 TATAAT 不同的启动子 a. 与标准启动子序列同源性越高 →启动强度越大 b. 与标准启动子同源性越低 →启动强度越小 c. 与标准启动子差异很大时 →由另一种σ因子启动

  37. 4） -10和-35之间距离： • 间距非常重要，16-19bp的间距转录效率最高，碱基序列并不重要 • 间距上的突变种类： 间距趋向于17bp → 上升突变 间距远离17bp → 下降突变 原因： • 该距离大致是双螺旋绕两圈的长度。这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，此酶结合在双螺旋的一面。 • 原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列之一。RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，需要有辅助蛋白质的帮助。

  38. 5）启动子附近其他DNA序列： • 起始位点上游50到150bp之间的序列是启动子的完全活性所必需的。 • 上游序列可以吸引拓扑异构酶，后者可导致结合的局部产生有利于转录起始的超螺旋状态。 • 远离部位序列富有AT，能增进转录起始的频率。

  39. 保守序列 大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区 T80A95T45A60T96 T82T84G78A65C54A45

  40. 第二节 启动子 1 原核生物的启动子 2 真核生物的启动子

  41. 2 真核生物的启动子 2.1 RNApolⅡ的启动子 2.2 RNApol I的启动子 2.3 RNApol III的启动子 三种 RNApol → 三种转录方式 三种启动子 → 三类基因，Ⅰ类 Ⅱ类 Ⅲ类

  42. 2.1 RNApolⅡ的启动子 • 通用型启动子（无组织特异性） • 结构最复杂 • 位于转录起始点的上游 • 有多个短序列元件组成

  43. （1） 帽子位点（cap site）：转录起始位点 与Prok.的相似 ，多为A （2） TATA框（Hogness 框或 Goldberg-Hogness 框） 结构特点： • 位于－30处 • 一致序列为T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37） 功能： • 定位转录起始点 （类似原核的Pribnow框）, 也称为选择子（selector） • TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的

  44. （3） CAAT框（CAAT box） 结构特点： • 位于－75bp处 • 一致序列为GGC/TCAATCT 功能： • 前两个 G 的作用十分重要(转录效率) • 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 （距转录起始点的距离，正反方向） ☻ 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在

  45. （4） GC框 （GC box） • 位于－90附近，较常见的成分 • 核心序列为GGGCGG • 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列 （5）其他元件 • 八聚核苷酸元件（octamer element OCT元件） 一致序列为 ATTTGCAT • KB元件 一致序列为 GGGACTTTCC • ATF元件 一致序列为 GTGACGT • 以及还有一些位于起始点下游的相关元件

  46. (6) 起始子（initiator，Inr）： • 位于起始点 -3～+5 • Py2CAPy5构成， • 可能提供RNA pol Ⅱ识别。 • 当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的作用， • 无论TATA是否存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的 。

  47. 小结--- 与原核生物启动子的比较： （1）多种元件：TATA框，GC框，CAAT框，OCT等； （2）不同元件的组合情况：位置、序列、距离和方向都不完全相同； （3）需转录因子参与转录的全过程：转录因子先和启动子结合，再与RNA聚合酶一起形成转录起始复合物，开始转录的过程。

  48. 真核启动子含有不同的组件 SV40 早期启动子 胸苷激酶 组蛋白H2B -140 -120 -100 -80 -60 -40 -20 +1 Oct CAAT GC TATA

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