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高级生物化学实验

高级生物化学实验. 实验一、转录增强因子在 DNA 转录中的 调控作用 – 16 学时. 一 . 目的和要求. 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习 PCR 克隆转录增强因子 CRE ，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。. 二 . 基本原理. 报告基因 (reporter gene) 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。

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高级生物化学实验

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Presentation Transcript

  1. 高级生物化学实验

  2. 实验一、转录增强因子在DNA转录中的 调控作用 – 16学时

  3. 一.目的和要求 1. 掌握转录增强因子对启动子控制下报告基因调控的工作原理，了解常见的报告基因种类及启动子种类。 2. 学习PCR克隆转录增强因子CRE，构建报告基因表达载体、细胞培养、细胞转染和荧光素酶活性检测技术。

  4. 二.基本原理 • 报告基因 (reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因。把它的编码序列和其它基因相融合形成嵌合基因，当在调控序列控制下进行表达时，利用报告基因的表达产物可以来标定目的基因的表达调控。 • 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。

  5. 在动物基因表达调控的研究中，常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因、荧光蛋白、荧光素酶基因等。荧光素酶(Luciferase) 是生物体内催化荧光素或脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。自然界有许多发光生物, 1956年, McElroy 等首次从萤火虫中提取到荧光素酶, 此后各国研究人员相继报道了对各种发光生物中荧光素酶的研究。萤火虫荧光素酶是分子量为60～64kD的多肽链,在Mg2+、ATP、O2存在时,催化D-荧光素(D-Luciferin)氧化脱羧,发出光(λ=550～580nm)。荧光素酶作为新型报告基因，与传统报告基因相比，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，因此在基因工程方面得到了广泛的采用，同时荧光素酶在发光免疫分析及环境监测、微生物检测等方面的应用也愈来愈受到关注。

  6. 调控元件的选择依赖于特定的信号转导途径。很多情况下，GPCRs的活化信号可通过特定的信号转导途径将信息传递至细胞核，调控特定基因的转录。多种自然和合成的调控元件都广泛用于报告基因系统。自然启动子，如c-fos启动子，含有Serum inducible element(SIE)、Serum response element（SRE）、cAMP response element（CRE）等一系列转录因子结合位点，这些调控元件使得该启动子同时受多重信号转导事件的调控。人工合成的启动子中可加入多个单一调控元件，如cAMP反应元件（CRE）。

  7. G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）通过与异源三聚体G蛋白的相互作用广泛参与胞内第二信使的调控，从而实现细胞外到细胞内乃至细胞核的信息流通。受体激活后，G蛋白解离为α亚基和βγ亚基并各自激活胞内信号。其中，与Gaq相偶联的GPCRs通过激活磷脂酶Cβ（PLCβ）使质膜上的4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）水解成1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）和二酰基甘油（DG）两个第二信使。IP3与内质网上的IP3配体结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活各类钙离子依赖蛋白。DG可活化与质膜结合的蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC），活化后的PKC通过磷酸化蛋白质的丝氨酸/苏氨酸促使细胞产生不同的反应；与Gas偶联的GPCRs通过激活腺苷酸环化酶（adenylyle cyclase，AC）产生cAMP；与Gai相偶联的GPCRs抑制AC并减弱cAMP水平。同时，来自Gai和其他G蛋白的βγ亚基可通过激活有丝分裂激活蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinase，MAP kinase）途径从而活化一系列效应系统。

  8. Gas偶联的GPCRs，在激动剂结合后，可造成胞内cAMP水平的升高，进而激活PKA。活化后的PKA可通过磷酸化CREB（CRE binding protein），促使CREB入核并与特定基因的CRE启动子序列结合，从而促进基因转录。促生长素抑制素（somatostatin）、绒毛膜促性腺激素（α-chorionic-gonadotrophin）和促肾上腺皮质素释放激素（corticotrophin-releasing hormone）基因启动子中的CRE序列由TGACGTCA组成，而c-fos启动子中的CRE则由TGACGTTT组成。

  9. 抗原刺激T细胞后可激活PLC，接着PLC活化转录因子NFAT（nucler factor of activated T cells）。PLC激活后可通过水解磷酸肌醇增加肌醇磷酸和二酰基甘油的浓度，后两者分别可增加胞内钙离子水平和激活PKC，PKC可促进AP-1即刻早期基因的两组成蛋白Fos和Jun的形成。而钙离子的升高可激活依赖钙调蛋白的磷酸酯酶（calcineurin），使NFAT去磷酸化并入核与Fos和Jun形成转录复合物，最终协同诱导NFAT和AP-1反应元件控制下基因的表达。 • 血清反应元件（SRE）通过MAP激酶途径激活。SRE由血清反应因子和三元复合因子（如：Elk-1）组成。MAP激酶通过磷酸化三元复合因子而使复合物起始转录。来自于Gai的βγ亚基通过激活Ras依赖的MAP激酶激活此条途径，而通过Gaq偶联的受体则依赖PKC的激活而活化MAP激酶途径。

  10. 三、材料与试剂 • 3.1 实验材料 • (1) 基因组DNA 及CRE-VIP专一性引物 • (2) HEK293（人胚肾细胞株）

  11. 3.2 实验试剂 • (1) PCR试剂盒。 • (2) PBS • (3) 胰酶 • (4) DMEM培养基 • (5) 胎牛血清 • (6) 转染试剂 （脂质体转染试剂、 磷酸钙转染试剂） • (7) 激动剂、拮抗剂 • (8) Forskolin • (9) 荧光素酶检测试剂盒

  12. 3.3 实验器材 • PCR管和EP管；②微量移液枪；③细胞培养器材（100 mm dish、6-well palte、24-well palte、移液管）④离心机；⑤PCR扩增仪；⑥核酸电泳仪；⑦凝胶成像仪；⑧细胞超净台；⑨细胞培养箱；⑩倒置相差显微镜

  13. 四、操作方法 • 4.1人类基因组DNA提取（略） • 4.2 基因组DNA 扩增VIP-CRE序列 • CRE-VIP代表一个CRE序列和一个VIP序列，它的长度为290bp。以人类基因组DNA为模板进行PCR扩增,两端的酶切位点分别为BamH I和Hind III。 • 上游引物（酶切位点为BamH I）5’-GGATCCACTTCAAGCCCTATTCATCCCATGG-3’ 下游引物（酶切位点为HIndIII）5’-AAGCTTCTCGCCCAGTCGTGCTCCCC-3’

  14. PCR反应液组成 • Buffer：5μl • ddH2O：37μl • 模板（基因组）：2μl • 引物（上）：1μl • 引物（下）：1μl • dNTP（10mM）：4μl • Tap酶：0.25μl • CRE-VIP的PCR扩增条件： • 94℃(5min)－[94℃（1min）－56℃（50s）－72℃（40S）]30cycles-72℃(5min)

  15. 4.4 质粒提取及检测 • 所用质粒为PCMV-CB1 和 PBLUESCRIPT-3CRE-VIP-荧光素酶

  16. 4.5 细胞培养 • 培养条件 • 细胞培养基：含10%FBS的DMEM/Low Glucose • 温度：37度 • 二氧化碳浓度：5% • 传代方案 • 1. 待细胞汇合度达到80-90%时，弃培养液。 • 2. 用1X PBS 漂洗细胞。漂洗后，将PBS吸出。 • 3. 用含有0.25% (w/v) 的胰酶快速润湿细胞，润湿完毕后，弃胰酶并放置37度CO2培养箱孵育1-5分钟。 • 4. 消化期间可在显微镜中观察，若发现细胞变圆，立即停止孵育，加适当培养液。 • 5. 用吸管或枪头轻轻吹匀后根据实验需要选择合适的传代密度，推荐1:2至1:5。

  17. 4.6 转染 • 此实验步骤适合于进行6孔板贴壁细胞的瞬时或稳定转染。 • 1. 收获细胞，将处于生长状态良好的293细胞，以3-5×105的密度接种于6孔培养板中。 • 在37℃，5％CO2培养箱中继续培养18－24h。 • 2. 转染

  18. 五、细胞模型的功能检测 • 细胞准备 • 1.将6孔板中转染后的293细胞，以合适密度接种于48孔培养板中。 • 2. 在37℃，5％CO2培养箱中培养18-24h，使在进行实验的当天细胞达到70-80％的汇合度。

  19. 药物刺激 • 1. 提供CB1的激动剂WIN-55212-2， CB1的拮抗剂SR141716。 • 2. a.加含不同浓度WIN-55212-2的培养基，做激动剂刺激实验。设对照。设置平行组。 • B.加含100nM 的WIN-55212－2 的不同浓度的SR141716培养基，做拮抗剂功能实验。另设一空白对照、一正对照及一孔只含100nM WIN-55212－2。设置平行组。 • 3. 于37℃，5％CO2培养箱培养中孵育4-5小时后，按荧光素酶报告基因检测部分，测定荧光素酶活性

  20. 荧光素酶报告基因检测 • 1. 将细胞培养基从待检细胞中吸出。 • 2. 向细胞培养板中加入适当的1X 裂解缓冲液（48孔板：50ul）。冰浴裂解10min。 • 3. 为萤光光度计(BERTHOLD, FB12 Luminometer)设置合适的时间延迟及测量时间。典型的延迟时间为2 秒，典型的读数时间为4秒。 • 4. 取25μl 萤光素酶检测试剂加入事先收集的25μl细胞裂解上清液中，马上放入萤光光度计中读数。如果产生的光强度足够，可以缩短检测时间。 • 5. 记录结果。

  21. 六、作图分析、讨论（PRISM绘图软件） • 实验设计（三选二）： • A.不同转染试剂：lipofectamine 2000 • 磷酸钙转染试剂 • B.不同的质粒比例 • C.激动剂和拮抗剂

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