GENETICA FORWARD E REVERSE

1. GENETICA FORWARD E REVERSE Obiettivo: assegnare una funzione ad ogni gene principali strategie sistematiche per risalire alla funzione di un gene nelle piante. Sebbene molte delle tecniche descritte sono utilizzate esclusivamente in ambito vegetale, le strategie generali possono essere generalizzate anche ad altri sistemi. Il metodo classico per determinare la funzione di un gene si basa sulla ricerca e interpretazione di mutazioni in quel gene. Questo metodo si basa sulla mutagenesi sistematica delle sequenze geniche e produce collezioni di mutazioni (prevalentemente recessive) di tipo “loss of function”. La caratterizzazione genetica e funzionale di queste mutazioni riesce, in molti casi, ad assegnare una funzione al gene in analisi. A partire da questa informazione si risale alla sequenza genica, utilizzando varie tecniche di clonaggio. Questo approccio che parte dalla funzione per risalire al gene è noto come genetica diretta(forward genetics).

2. La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato l’approccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Per esempio è possibile generare piante transgeniche ed esprimere il gene in versione senso o antisenso, per studiarne il fenotipo e, da questo, cercare di dedurre la funzione del gene. Formalmente questo significa generare mutazioni (dominanti) di tipo “gain of function” Allo stesso scopo, ma in maniera più sistematica, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene d’interesse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa(reverse genetics).

3. Fenotipo??? Fenotipo FORWARD mutante T-DNA Gene REVERSE PCR-screening Funzione??? Funzione Gene

4. Aumento espressione del gene endogeno: • forte costitutiva • ectopica • inducibile • Riduzione/silenziamento del gene endogeno: • AntiSENSO • RNAi • co-soppressione, Strategie molecolari per studiare la funzione di un gene nelle piante • Knock Out del gene..... • genetica forward • genetica reverse

5. Strategie genetiche per studiare la funzione genica Inattivazione di un gene per identificare e caratterizzare un fenotipo Non tutti i geni sono “mutagenizzabili” perché: • geni funzionalmente ridondanti • (geni a funzione simile ma non omologhi) • (ridondanza strutturale v/s ridondanza funzionale) • geni coivolti in diverse fasi dello sviluppo, e mutazioni in tali geni possono causare fenotipi letali o pleiotropici

6. Knock Out del gene..... mutagenesi sito-specifica v/s mutagenesi inserzionale “random” Nelle piante No mutagenesi sito-specifica!!!!! Quindi............ mutagenesi inserzionale “random”

7. Strategie di Mutagenesi Inserzionale • a) T-DNA • mutageno inserzionale che produce inserzioni stabili • no “hot spots” di integrazione • b) Trasposoni • il trasposone può essere exciso dal gene inattivato • (reversione del fenotipo = complementazione) • eventi di trasposizione avvengono in zone limitrofe al sito di inserzione

8. Transposon tagging • Il sistema Ac/Ds (agente in trans) • Elementi Ac: (4563 bp) codificano per una trasposasi • ElementiDs: corrispondono ad elementi Ac deleti della trasposasi • Caratteristiche del sistema Ac/Ds in mais: • contiene delle IR di 11-bp alle estremità, essenziali • codifica per una proteina di 92kDa con attività di trasposasi • 101 aa N-ter non necessari per la trasposizione • circa 200 bp ad ogni estremità sono necessari per la trasposizione • la trasposasi lega un esamero AAACGG • dopo trasposizione vengono generati dei DR di 8-bp • altri residui di DNA vengono lasciati a seguito della trasposizione • gli elementi DS sono deleti o della trasposasi o delle IRs

9. Transposon tagging • Barbara Mc Clintock è stato il 1°scienziato a predirre che i trasposoni, elementi genetici mobili, erano presenti nei genomi eucariotici. Lei ha isolato il sistema Ac/Ds da mais. • Il sistema Ac/Ds è stato utilizzato in Arabidopsis x generare collezioni di mutanti. La bassa attività dell’elemento Ac, è stata aumentata usando la trasposasi sotto il 35S. Cmq la frequenza di reinserzione dell’elemento Ac è relativamente bassa. Ciò puo’ anche dipendere da successive trasposizioni dell’elemento, dovuto a mancato controllo dell’attività di trasposizione. Un’alternativa a ciò è l’uso della trasposasi sotto controllo di un promotore HS. • Elementi trasponibili isolati da mais e Antirrhinum sono utilizzati in altre specie nelle quali risultano assolutamente attivi.

10. Vantaggi del Transposon Tagging • Evitare mutazioni indesiderate (dovute all’evento di trasformazione).Cosi la mutagenesi è separata dalla trasformazione perchè la trasposasi ed il trasposone/T-DNA (Ds)sono trasformati in 2 diverse piante. La trasposizione avviene solo in seguito all’incrocio tra le due linee. • Ottenere mutazioni stabili che possono revertire. Una mutazione causata da un trasposone inerte è stabile finchè il trasposone non è mobilizzato da una trasposasi, in seguito a reincrocio. Quando il trasposone salta lascia il “footprint”, ma il fenotipo PUO’ comunque revertire. • Ottenere nuove mutazioni. Quando il trasposone salta e lascia il “footprint” questo può causare una nuova mutazione (frameshift, inserzioni aminoacidiche) • “Taggare” il gene d’interesse x inserzione. I trasposoni di tipo Ac fanno trasposizioni “short-range”. Identificando una linea con trasposone inerte che mappa vicino al gene d’interesse, si mobilizza il trasposone x incrocio con la trasposasi e si seleziona il “salto” nel gene.

11. T-DNA tagging • Inserzione del T-DNA nel genoma vegetale mediante una “illegitimate recombination” • No hot spots di integrazione • Distribuzione random sui 5 cromosomi di Arabidopsis • Produzione di >18000 FSTs (Flanking Sequence Tags) x analisi dei T-DNA IS • RISULTATI • 40% delle integrazioni sono in geni • Nessuna categoria di geni è particolare bersaglio di integrazione • FSTs più frequenti negli introni che negli esoni (43FSTs/Mb v/s 33FSTs/Mb) • LB spesso integrato full-length, mentre RB risulta spesso troncata • Coinvolgimento di “microsimilarità” tra LB e la sequenza vegetale preIS • Integrazione influenzata anche dalla composizione nucleotidica • Preferenza per regioni T-rich (i.e. promotori e introni)

12. Mutagenesi inserzionale “genomica” Quante linee bisogna produrre per saturare il genoma? Calcolo teorico: Il T-DNA si inserisce nel genoma seguendo una distribuzione di Poisson, quindi…… F (geni con almeno 1 inserzione= saturazione) =1 - e-m dovemrappresenta il numero medio di eventi per gene, i.e. m = numero di inserzioni indipendenti/numero di geni Se: 1.5 T-DNA locus per line 75/85% saturazione con 25.000 T-DNA lines Ma noi evidenziamo solo inserzioni in regioni codificanti, quindi ….CORREZIONE! 95% saturazione con circa 50.000 linee indipendenti

13. In Planta Vacuum Infiltration Raccolta semi T1 T0 Selezione in serra dei trasformanti T1 Basta resistenti Autoimpollinazione T2 Analisi in vitro delle plantule Kr Raccolta semi T2 Kr Ks • Analisi dei mutanti Kana resistenti • Propoagazione di piante omo ed eterozigoti Strategia di Isolamento Mutanti

14. Knockology

15. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

16. autoimpollinazione Analisi di segregazione T2 Plantsaa(Kr/Kr) Aa(Kr/Ks)AA(Ks/Ks) Total 96 19394 383 1 2 1 T3 Plants xy1(Kr) WT(Kr/Ks) Ks Total a 24 4726 97 b 25 4624 95 c 27 5528 110 e 121 0 0 121

17. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

18. 0,23 x 4,4 Digestione EcoRV: 0.23 Kb e 4,4 Kb interne al T-DNA x Kb fino al sito EcoRV sul DNA vegetale E.RV E.RV E.RV RB LB Erbic R GUS KanR Pnos 35S nos3’ ocs3’

19. NT Caratterizzazione Molecolare del sito di inserzione 1,8 Kb RB-LB IR 0,23 Kb 4,4 Kb 1,2 Kb RB-RB DR 0,23 Kb

20. Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Clonaggio delle “Flanking Sequences” Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana)

21. Analisi per PCR • Estrazione DNA dai singoli mutanti (da seme/embrione se il fenotipo è letale) • PCR con oligo specifici per il T-DNA: Kana, RB, LB, Basta • Analisi dei prodotti di PCR su gel/Southern blotting

22. Ma il T-DNA è legato (responsabile del) al fenotipo mutato??? • Analisi di segregazione • del marcatore e del fenotipo mutante • (inserzione T-DNA in 1 o più loci??) • Caratterizzazione molecolare del sito di inserzione • (T-DNA singolo, a tandem oppure inserzione più complessa??) • Analisi PCR su moooooolti mutanti • (es. mutante con fenotipo letale, • non è possibile ctrl la resistenza a Kana) • Clonaggio delle “Flanking Sequences”

23. Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

24. X X T-DNA Kana Amp GUS Ori Digestione X X T-DNA Ligazione intramolecolare T-DNA X X X Trasformazione E.coli Selezione colonie AmpR, su LB+Amp

25. Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) - Libreria genomica da DNA mutante, con screening con sonda T-DNA

26. X X T-DNA Kana GUS Digestione X X T-DNA Ligazione intramolecolare PCR T-DNA X CC CC

27. - Plasmid Rescue - Inverse PCR (IPCR) Strategie di clonaggio delle “Flanking Sequences” - Libreria genomica da DNA mutante

28. Libreria genomica da DNA mutante • Digestione del DNA genomico mutante (omozigote) o di plantula KanaR (eterozigote) con enzimi adeguati x il clonaggio • Clonaggio del DNA genomico così digerito, in vettori x librerie genomiche (l, cosmidi) • Trasformazione (per elettroporazione) di cellule competenti di E.coli • Screening della libreria genomica con sonda T-DNA (Kana, RB, LB, Basta) • Isolamento dei cloni positivi, sequenza delle FS • Amplificazione delle FS x utilizzarle come sonda su una libreria genomica/cDNA WT • Isolamento della copia WT del gene/cDNA che, inattivato, è responsabile del fenotipo

29. Il fenotipo mutante dipende dall’inserzione del T-DNA, cioé dall’inattivazione del gene X ??? DIMOSTRAZIONE FORMALE: COMPLEMENTAZIONE!!!!!!! • Complementazione: • Trasformazione della pianta mutante con una copia del gene WT, al fine di restaurare la funzione mancante • p35S::cDNAX • pX::cDNAX • pX::geneX

30. Un esempio: I mutanti pasticcino

31. pas1 pas1 WT WT V V S N E N X N B E N E N X S X T-DNA GUS LB RB