BORDI Christophe E-mail : bordi@ibsmrs-mrs.fr Tel. 04.91.16.41.26

1. Génomique fonctionnelle Application des Puces à ADN en Microbiologie BORDI Christophe E-mail : bordi@ibsm.cnrs-mrs.fr Tel. 04.91.16.41.26

2. Qu'est-ce que la génomique ? Définition: La génomique vise à dresser un inventaire de l'ensemble des gènes d'un organisme (génome), puis vise à comprendre comment les gènes contribuent de façon individuelle et collective à gérer les fonctions physiologiques de l’organisme. Génome - Séquence ADN des ou du chromosomes - Inventaire des gènes (annotation) - Recherche de séquences répétées génomique Post-génomique - Fonction des gènes (annotation fonctionnelle) - Leurs relations pour gérer les fonctions physiologiques de l’organisme

3. Techniques misent en place en génomique fonctionnelle Définition: La génomique vise à dresser un inventaire de l'ensemble des gènes d'un organisme (génome), puis vise à comprendre comment les gènes contribuent de façon individuelle et collective à gérer les fonctions physiologiques de l’organisme. génomique Application des Puces à ADN en Microbiologie

4. Application des Puces à ADN en Microbiologie Les puces à ADN est l’un des l’outil le plus abouti de la génomique qui vise à étudier la séquence et l’expression des génomes Identification des gènes impliqués dans un processus biologique la mesure du niveau d'expression de tous les gènes d'un génome : le transcriptome Identification des réseaux de régulation et comparaison aux autres espèces Bactériennes (génomique comparative) Microévolution d’une espèce dans le temps et dans l’espace Polymorphisme des populations bactériennes

5. Identification des gènes impliqués dans un processus biologique

6. Identification de gènes impliqués dans un processus biologique Actuellement la fonction de la majorité des gènes d’un organisme reste encore inconnue ou partiellement comprise Escherichia coli qui est depuis plus longtemps l’organisme le plus étudié à plus de la moitié de ses gènes qui a encore une fonction inconnue Un moyen d’identifier la fonction des gènes peut être une analyse de leur expression : quand interviennent-ils ? Dans quelles conditions ? - Exemple : La résistance des bactérie face aux antibiotiques. Qu’elles sont les gènes impliqués dans la résistance de E. coli face à l’ampicilline ?

7. Principe d’une expérience de puces à ADN Pour identifier les gènes spécifiquement contrôlés par l’ajout de l’ampicilline dans le milieu on va comparer le transcriptome d’une bactérie ayant poussée en présence d’ampicilline a une bactérie ayant poussée en absence d’ampicilline Condition de contrôle • Ampicilline Extraction des ARN Marquage des ADNc Révélation Hybridation Hybridation non-compétitive + Ampicilline Condition de test

8. Hybridation  compétitive - Dans les expériences de puces à ADN utilisant une hybridation compétitive, chacun des échantillons (condition d’expérience) est retro-transcrit séparément avec une fluorophore différents (cyanine 3 ou cyanine 5) sur des puces différentes - Les deux sondes sont mélangées et hybridées sur la même puce à ADN Condition de contrôle - Ampicilline Cy3 Extraction des ARN Marquage des ADNc Hybridation Cy5 + Ampicilline Condition de test - L’hybridation compétitive est utilisée uniquement avec les lames de verre

9. Salmonella Salmonella sont des entérobactéries bactéries à Gram négatifs, mobiles, aéro-anaérobies facultatives Quatre sérotypes de salmonella provoquent une maladie spécifique chez l’homme. S. typhi agent étiologique de la fièvre typhoïde S. paratyphi A S. paratyphi B S. paratyphi C agent étiologique de la fièvre paratyphoïde Les germes pénètrent par voie digestive, traversent la muqueuse intestinale et envahissent le tissu lymphoïde pré-intestinal. De là, le germe passe avec la lymphe dans la circulation, ce qui entraîne un état septicémique. Les salmonelle échappent au système immunitaire en tuant les macrophages en charge de les éliminer

10. 5 3 1 2 4 Mode d’action du macrophage Bact 1- Les bactéries sont phagocytées par le macrophage Phagosome Bact 2- Les bactéries sont enveloppées dans un vacuole: le phagosome lysosome 3- Les vésicules de le phagosome vont fusionnées avec, qui contiennent des hydrolases acides, qui fonctionnent à un pH acide Bact Phagolysosome 4- Les hydrolases dégradent les bactéries Golgi Bact 5- Les résidus de bactéries sont éliminés Vacuole digestive Noyau Bact

11. Sal Sal Sal 1 2 5 3 4 Sal Sal Phagosome Sal lysosome SCV Sal Sal Sal Sal Sal Phagolysosome Golgi Noyau Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella 1- Les salmonelles sont phagocytées par le macrophage 2- Les salmonellessont enveloppées dans un vacuole: le phagosome 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome au niveau du phagasome empêchant ainsi la constitution du phagolysosome 4- Les salmonelles vont modifier le contenu du phagosome afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi (nutriment + neutralisation du pH). La vésicule prend le nom de Salmonella-containing vesicle (SCV) 5- Les salmonelles tuent le Macrophage et sont libérées dans le milieu extérieur

12. 3 2 1 4 5 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella Sal Sal Sal Sal 1- Les salmonelles sont phagocytées par la cellule intestinale Sal Sal 2- Les salmonellessont enveloppées dans une vacuole lysosome SCV Sal Sal Sal Sal 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome empêchant ainsi la constitution de l’endosome Précose Sal Endosome précose 4- Les salmonelles vont modifier le contenu de la vésicule afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi (nutriment + neutralisation du pH). La vésicule prend le nom de Salmonella-containing vesicle (SCV) lysosome Golgi Endosome tardif 5- Les salmonelles tuent la cellule intestinaleet sont libérées dans le milieu extérieur Noyau

13. Conditions d’expérience pour l’étude du transcriptome Il serait intéressant de regarder le profil du transcriptome de la bactérie au cours de ce type d’infection Cela permettra: - L’identification des gènes impliqués dans la virulence de salmonella et proposer des cibles thérapeutiques - Assigner des fonctions potentielles à certains gènes de fonction inconnue - Avoir une vision mécanistique, dynamique et évolutive de la réponse bactérienne au cours de l’infection

14. Conditions d’expérience pour l’étude du transcriptome Salmonelle + extrait de macrophage Cy3 Extraction des ARN Marquage des ADNc Hybridation Cy5 Salmonelle dans les macrophages Le problème: La concentration en ARNm procaryote est faible et de plus mélangée avec l’ARN eucaryote

15. B B B B B B La méthode SCOTS SCOTS: Selective capture of transcribed sequences Extraction de l’ARN ARN proc 1- Extraction de l’ARN total (Eucaryote et procaryote) ARN euca Conversion en cDNA 2- Conversion de l’ARN en ADNc a l’aide d’amorces aléatoire modifiées avec une séquence spécifique de 20 nt environs en 5’ ADNc proc ADNc euca 3- Séparation de l’ADNc bactérien de l’ADNc eucaryote par capture sélective avec l’ADN génomique de la bactérie Enrichissement Par PCR Capture sélective SA 4- purification du complexe ADNc/ADN génomique (biotine /strepavidine) SA 6- Amplification de l’ADNc par PCR PCR

16. Mesure de l’enrichissement par la méthode SCOTS On mesure l’enrichissement en ARN procaryote à chaque tour par hybridation sur puce à ADN Nb gènes détectés On arrête l’enrichissement lorsque l’on peut détecter un nombre significatif de gènes

17. 3 4 1 2 Résultats Sal Phagosome Sal lysosome SCV Sal Sal Sal Sal Sal Phagolysosome Golgi On observe que le transcriptome de salmonella évolue au cours du temps (réponse adaptative à l’environnement) Noyau

18. Problématique de ceux type d’études

19. 5 3 4 2 1 Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella Sal Sal Sal Sal 1- Les salmonelles déclanchent leur propre phagocytose grâce au système de sécrétion de type 3 T3SS (Sp2) Sal Phagosome Sal 2- Les salmonellessont enveloppées dans une vacuole: le phagosome lysosome SCV Sal 3- Les salmonelles bloquent la fusion des vésicules de lysosome grâce au T3SS (Sp2) et modifie le transport de plusieurs ions dont le fer Sal Sal Sal Sal Phagolysosome 4- Les salmonelles vont modifier le contenu du phagosome afin de le rendre moins hostile en détournant des vésicules du golgi grâce au T3SS (Sp2) Golgi 5- Les salmonelles tuent le macrophage et sont libérées dans le milieu extérieur Noyau

20. Conclusions et remarques Grâce à l’utilisation des puces à ADN dans la comparaison de profil de transcription on peut : - Identifier des gènes impliqués dans la virulence de salmonella et proposer des cibles thérapeutiques - Assigner des fonctions potentielles à certains gènes de fonction inconnue - Avoir une vision mécanistique, dynamique et évolutive de la réponse bactérienne au cours de l’infection C’est déjà bien mais très incomplet Le problème ici c’est que l’on a qu’une vision globale de l’expression des gènes mais on a aucune idée du réseau qui contrôle quoi et comment - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

21. Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

22. Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

23. Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

24. Mécanisme d’infection intracellulaire de Salmonella - Quels sont les réseaux de régulation et les protéine qui y sont impliqués ? - Quels gènes dépendent de quels réseaux ?

25. Identification des réseaux de régulation génétique

26. Détection de l’environnement par les microorganismes - Exemple sur la régulation de la capture du fer chez les bactéries pathogènes

27. Mécanisme de régulation de la voie Fur - Présence d’un forte concentration de fer Périplasme MI Cytoplasme Fer Fur Fur Box Le répresseur Fur est complexé à deux atomes de fer qui lui donne une forte affinité pour l’ADN. Il se fixe sur l’ADN au niveau d’une séquence appelée Fur box et réprime l’expression des gènes qu’il contrôle

28. Mécanisme de régulation de la voie Fur - En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box Le répresseur Fur n’est plus complexé à deux atomes de fer.

29. Mécanisme de régulation de la voie Fur - En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box Le répresseur Fur n’est plus complexé à deux atomes de fer et perd sont affinité pour l’ADN

30. Mécanisme de régulation de la voie Fur - En carence en fer Périplasme MI Cytoplasme Fur Fur Box ARNm Les gènes cibles de la protéine Fur sont exprimés et permettent la capture du fer libre « the iron War »

31. Les approches misent en place pour l’identification des réseaux - Comparaison de profil de transcription d’une souche sauvage contre un mutant du régulateur Fur en condition de carence en fer - Approche très limitée car risque important de faux positif lié au cascade de régulation et au manque de fer -Recherche de la séquence de la fur box sur le génome - Approche peu efficace car le motif de fixation est souvent « complexe » et mal maîtrisé par manque de séquence à aligner. Cela conduit souvent à un grand nombre de faux positif - Approche pas applicable au nouveau régulateur dont la séquence de fixation n’est pas caractérisée - La méthode de Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip (abrégée ChIP on chip) - Approche global qui va permettre d’identifier toutes les régions de l’ADN qui fixent un régulateur

32. Principe du Chip-chip La méthode de Chromatin ImmunoPrecipitation on Chip (abrégée ChIP on chip) permet l'étude des protéines interagissant avec l'ADN. Il s'agit d'une combinaison de la technique de Chromatin Immunoprecipitation avec la méthode des puces à ADN. Ici seuls les gènes dont les régions régulatrices fixent la protéine vont donner un signal sur la puce (on ne voit que les régulations directes)

33. Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori Les auteurs vont chercher à identifier les gènes qui sont sous le contrôle direct du régulateur Fur Pour cela ils réalisent 2 conditions d’expériences différentes Souche WT + fer Souche Dfur + fer

34. Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori La première étape d’une expérience de Chip on chip consiste à faire un cross link du complexe ADN/régulateur Il faut donc rechercher le moment optimum pour former le complexe Le moment optimum est entre une DO De 0.9 et 1.1

35. Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori Chip-chip 175 gènes semble être sous le contrôle direct du régulateur Fur (on ne voit pas les indirectes d’où intérêt de combiner avec le transcriptome)

36. Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori Grâce à l’utilisation du Chip on chip on peut identifier d’un seul coup l’ensemble des gènes que contrôle un régulateur Grâce à l’utilisation du Chip on chip on peut donc définir des réseaux de régulation Fur Fur box

37. Application du Chip-chip sur le régulon Fur chez H. pylori La matrice de poids/position est assez Fiable (robuste) dans ce cas car générée à partir de plus de 175 séquences Génomique comparative

38. Identification des réseaux de régulation génétique et Génomique comparative

39. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF Cas de sigma E - Absence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma Pas d’expression des gènes sous le contrôle du facteur sigma

40. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

41. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

42. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

43. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

44. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme Facteur sigma

45. La voie des sigma facteurs alternatifs de type ECF - Présence de stimuli Périplasme Anti-sigma Protéase MI Cytoplasme ARN polymérase Expression des gènes sous le contrôle du facteur sigma

46. Structure d’un promoteur • Il comprend au moins deux boites: - La boite -10 au TATA box - La boite -35 • L’espacement entre les deux boites est assez conservé ( 17 nt pour sigma 70)

47. Condition de contrôle (E.coli K12) Cy3 Extraction des ARN Marquage des ADNc Hybridation Cy5 Condition de test (E.coli K12+surexpression de sigma E) Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E Objectif: Identifier de manière globale les gènes sous le contrôle direct du facteur sigma E Méthode employée: Étude du transcriptome Les conditions d’expérience

48. Méthodes de normalisation: Lowess Identification des gènes significativement induit: T-test 96 gènes régulés par sigma E regroupés dans 50 TU (transcription unit) Sur les 50 TU: 42 induites (rouges) et 8 réprimées (vert) Quels sont les risques de cette approche ? Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E - Évolution de la transcription au cours du temps Avec 4 expériences pour chaque temps - Méthodes d’analyse: - Résultats:

49. Identification des gènes contrôlés par le facteur sigma E - Sur les 42 TU identifiées ils montrent que seulement 28 sont sous le contrôle direct du facteur sigma E - De plus pour chacune des 28 TU il détermine le +1 de transcription par RACE PCR

50. Résultats