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实验二

实验二. 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶. 一、实验目的和要求 1 、学习离子交换层析的基本原理； 2 、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3 、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1 、离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC ）

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Presentation Transcript

  1. 实验二 离子交换柱层析分离纯化蔗糖酶

  2. 一、实验目的和要求 1、学习离子交换层析的基本原理； 2、学习离子交换层析分离蛋白质的基本方法和技术； 3、学习蔗糖酶活性检测的基本原理和方法。 二、实验基本原理 1、离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为IEC） 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是以离子交换剂为固定相，根据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换剂与流动相中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一被洗脱下来，达到分离的目的。

  3. 离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。 基质 电荷基团 反离子 ＋ （交联纤维素、交联葡聚糖、交联琼脂糖) ＋ 可逆交换 ＋ ＋ — 基质 阳离子交换剂 电荷基团 反离子 溶液中的离子 或离子化合物 — 可逆交换 ＋ — — 基质 阴离子交换剂 — 电荷基团 反离子 溶液中的离子 或离子化合物

  4. 2、酶活力检测(定性检测） 蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解酶。它能催化非还原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷键裂解，将蔗糖水解为等量的葡萄糖和果糖（还原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol还原糖。还原糖的测定有多种方法，如采用3.5－二硝基水杨酸法，其原理是3.5－二硝基水杨酸与还原糖共热被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。 本实验在离子交换层析分离纯化的过程中，对分离纯化样品采用3.5－二硝基水杨酸法来初步判定样品中还原糖含量的多少，由此来确定并收集蔗糖酶纯化样品。

  5. 三、实验材料与试剂 1、实验材料 蔗糖酶粗分离纯化样品Ⅲ 2、实验试剂 ⑴ DEAE-Sepharose Fast Flow (弱碱性阴离子交换剂)； ⑵ 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液； ⑶ 20mmol/L Tris-HCl，（1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液(学生自配）； ⑷ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.5 ； ⑸ 5%蔗糖溶液 ； ⑹ 3，5-二硝基水杨酸试剂 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。

  6. 四、实验器材与仪器 1、高速冷冻离心机； 2、层析柱（φ1.0×20㎝ ）(1支/组）； 3、恒流泵（流速0.8～1ml/min）(10rpm)（1台/组）； 4、梯度混合器(100ml梯度杯)（1套/组）； 5、核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A）（1台/组） ； 6、记录仪（纸速：0.5mm/min；灵敏度：50mV）（1台/组） ； 7、部分收集器及收集试管（4ml/管）（1台/组） ； 8、铁架台、夹子 （固定层析柱用）（1套/组） ； 9、－20℃冰箱（保存样品用）； 10、1.5ml离心管（留样品Ⅲ和样品Ⅳ用）； 11、 7ml离心管（留样品Ⅳ用） ； 12、恒温水浴（100℃）； 13、试管、移液管、试管架等。

  7. 五、实验操作方法和步骤 1、离子交换剂准备：(实验室已准备好） DEAE—Sephadex， 取适量DEAE—Sephadex，加入0.5mol/L NaOH溶液，轻轻搅拌，浸泡0.5小时，用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，加 50ml 0.5 mol/L HCl, 搅匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性，（DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。浸入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液中平衡备用。 DEAE- Sepharose Fast Flow， （ 按说明书处理）

  8. 2、样品处理： 将乙醇沉淀的蔗糖酶蛋白样品充分溶解于15ml 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液；4℃ 15000r/min, 离心10分钟，收集样品上清液（样品Ⅲ）测量总体积(ml数），留取1ml（样品Ⅲ）用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力的测定以及用于SDS-PAGE分析；将其余样品（样品Ⅲ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先取50ul酶液做酶活力检测）。 3、纯化检测仪器连接： 将梯度混合器(100ml梯度杯)，层析柱（φ1.0×20㎝ ），恒流泵 (10rpm) （流速0.8～1ml/min），核酸蛋白检测仪（灵敏度0.5A），记录仪（纸速：0.5mm/min，50mV）、部分收集器（4～5 ml/管/5min）等按下图连接并设置好。

  9. 纯化检测仪器连接示意图 部分收集器 层析柱（φ1.0×20㎝ ） 2 1 DEAE- Sepharose Fast Flow 梯度混合器 核酸蛋白检测仪 恒流泵 记录仪 1、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液 2、 50ml 20mmol/L Tris-HCl，（ 1mol/L NaCl） pH7.3缓冲液

  10. 4、装柱(层析柱规格1×20cm)、平衡 ： 装柱前先调好流速0.8ml～1ml/min，然后将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow，轻轻搅匀（注意不能太稀，也不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续加进柱内至层析柱上端。注意不能带进气泡，待凝胶自然沉积离柱管上端约1-2cm后松开层析柱出口，控制流速 0.8ml～1ml/min；待柱内DEAE —Sepharose Fast Flow 凝胶沉降至稳定高度并分出水层后，吸去水层，用玻棒将沉降界面搅匀，再补加处理好的DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶，直到凝胶沉降至稳定高度距层析柱上端约3cm处为止（这时须保持DEAE—Sepharose Fast Flow凝胶柱面平整）。用20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液连通层析柱，进行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。 5、加样： 停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。待缓冲液液面与胶体表面相切时，恒流泵停止工作。用胶头滴管缓慢将蔗糖酶蛋白样品溶液（样品Ⅲ）加入层析柱中，注意顺着柱壁滴加，尽可能保持胶面平整。打开恒流泵，使样品溶液进入胶体，待样品溶液完全进入胶体后，用少量洗脱缓冲液将残余在层析柱壁上端的样品洗下，并完全进入胶体后，再加洗脱缓冲液至一定高度。

  11. 6、洗脱： 梯度洗脱法： 加样后，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液进行平衡，洗脱流速为0.8ml～1ml/min，洗去未被DEAE —Sepharose Fast Flow凝胶吸附的杂蛋白，待层析柱流出液在核酸蛋白检测仪上绘出的基线稳定，用20mmol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液NaCl梯度洗脱（浓度为0-1mol/L NaCl ），层析柱联上梯度混合器，混合器中分别为50ml 0.05mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液和50ml含1mol/L NaCl的0.05ml/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。洗脱流速为0.8～1ml/min，每4ml接一管，洗脱至缓冲溶液流完为止。跟踪测定各管的蔗糖酶活力，将蔗糖酶活力高的若干管酶液集中，测量总体积（ml数）（样品Ⅳ），并留样用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定、SDS-PAGE分析、酶的基本性质实验和用于“用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响”（半自主性设计实验） ，样品－20℃低温保存备用。

  12. 7、蔗糖酶活力检测 收集活力高的蔗糖酶液，测量总体积(ml数) （样品Ⅳ），-20℃保存备用，用于蔗糖酶蛋白含量测定、蔗糖酶活力测定和SDS-PAGE分析以及用于用正交法测定几种因素对蔗糖酶活性的影响（半自主性设计实验）。 六、结果分析讨论

  13. 下 次 实 验 实验三 蔗糖酶蛋白含量的测定——Folin-酚法 实验四蔗糖酶活力测定——3.5－二硝基水杨酸法

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