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Metodi per ottenere informazioni sulla sequenza aminoacidica delle proteine

Metodi per ottenere informazioni sulla sequenza aminoacidica delle proteine. Composizione amminoacidica. Derivatizzazione post-colonna. Derivatizzazione post-colonna. Determinazione dell’estremità N-terminale. Metodo di Sanger (FDNB) ed altri reattivi. Degradazione di Edman.

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Metodi per ottenere informazioni sulla sequenza aminoacidica delle proteine

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Presentation Transcript

  1. Metodi per ottenere informazioni sulla sequenza aminoacidica delle proteine

  2. Composizione amminoacidica Derivatizzazione post-colonna

  3. Derivatizzazione post-colonna

  4. Determinazione dell’estremità N-terminale

  5. Metodo di Sanger (FDNB) ed altri reattivi

  6. Degradazione di Edman

  7. Sequenziamento automatico

  8. Proteolisi specifica • Enzimi (endoproteinasi) • Reattivi (es. bromuro di cianogeno)

  9. Chemical cleavage  Cyanogen bromide Carboxyl side of methionine residues O-Iodosobenzoate Carboxyl side of tryptophan residues  Hydroxylamine Asparagine-glycine bonds  2-Nitro-5-thiocyanobenzoate Amino side of cysteine residues Enzymatic cleavage  Trypsin Carboxyl side of lysine and arginine residues  Clostripain Carboxyl side of arginine residues  Staphylococcal protease Carboxyl side of aspartate and glutamate residues (glutamate only under certain conditions)  Thrombin Carboxyl side of arginine  Chymotrypsin Carboxyl side of tyrosine, tryptophan, phenylalanine, leucine, and methionine  Carboxypeptidase A Amino side of C-terminal amino acid (not arginine, lysine, or proline)

  10. Ricostruzione della sequenza

  11.  Se condotta in condizioni non riducenti permette di riconoscere residui Cys esposti Alchilazione delle cisteine

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