Download
1 / 25
380 likes | 706 Views
به نام خدا. Agroinoculation. استاد مربوطه جناب آقای دکتر صباغ توسط محمود شهابی. مقدمه. انتقال ژن فرآیندی است که طی آن، قطعه مشخصی از DNA به درون سلولها وارد میشود.
E N D
به نام خدا Agroinoculation استاد مربوطه جناب آقای دکتر صباغ توسط محمود شهابی
مقدمه • انتقال ژن فرآیندی است که طی آن، قطعه مشخصی از DNA به درون سلولها وارد میشود. • به انتقال هدایت شده ژن از یک موجود زنده به موجود زنده دیگر و تلفیق و بیان پایدار آن ژن در ژنوم موجود پذیرنده، انتقال ژنتیکی ( تراژنی) گفته می شود. • ژن منتقل شده تراژن(Transgene) نامیده می شود. • سیستم اگروباکتریوم اولین سیستم تراریختی موفق در گیاهان می باشد (1983) • غلبه بر دستکاری ژن های گیاهی با شناخت خصوصیات و بهره برداری از پلازمیدهای Ti و Ri محقق گردید • این پلازمید ها امکان انتقال طبیعی ژن، بیان ژن و سیستم های گزینش را فراهم می کنند.
Agrobacterium • باکتری گرم منفی، میله ای شکل • متعلق به خانواده Rhizobiaceae • اغلب در نزدیکی سطح خاک (در ناحیه طوقه)
Agrobacterium • A. tumefaciensعامل بیماری گال طوقه و دارای پلازمید Ti • A. Rhizogenesعامل بیماری ریشه موئی و دارای پلازمید Ri • A. Radiobacterگونه غیر بیماریزا و بدون پلازمید براساس خوصیات بیماریزایی و داشتن پلازمید Ti و Ri طبقه بندی قدیمی این جنس شامل امروزه A. tumefacience به عنوان موثرترین مهندس ژنتیک گیاهی در طبیعت مطرح شده است
سازماندهی پلازمید Ti • مولکول های حلقوی بزرگ (800-200 کیلو باز) • به صورت واحد های ژنتیکی خود تکثیر در سلول های باکتریایی • دارای مناطق بزرگی برای بیماری زایی، شروع همانند سازی، سرطان زایی و کاتابولیسم اپین ها هستند
سازماندهی پلازمید Ti • قسمتی از پلازمید Ti که به گیاه منتقل می شود T-DNA نام دارد. • در منطقه T-DNA هیچ ژنی که برای انتقال آن به گیاه ضروری باشد، وجود ندارد. • این منطقه ژن های سرطان زا را در بر می گیرد. ژن های سرطان زا جهت تومورزایی و ساخته شدن اپین ها ضروری اند پلازمید Ti خلع سلاح شده
انتقال T-DNA جهت انتقال T-DNA به سلول گیاه سه عامل مورد نیاز می باشد. • مرز راست و چپ T-DNA • ژن های ناحیه vir • ژن های کروموزومی مانند chvA، chvB و pscA
ناقل های مبتنی بر آگروباکتریوم ساده ترین روش برای بهره گرفتن از پلازمید Ti جهت انتقال ژن به گیاهان، وارد کردن توالی ژن مورد نظر به داخل ناحیه T-DNA و سپس استفاده از پلازمید Ti و باکتری A.tumefacienceمی باشد تا این توالی ژنی را وارد سلول گیاه کرده و به داخل ژنوم گیاه الحاق کند.
دلایل عدم استفاده مستقیم از پلازمید Ti • تولید هورمون های گیاهی توسط سلول های ترنسفورم شده در محیط کشت، که از باززایی آنها به گیاهان بالغ جلوگیری می کند. • تولید اپین با استفاده از منابع گیاهی در صورت حذف نشدن ژن تولید اپین • اندازه بزرگ پلازمید Ti • فقدان مکان های برشی منحصر به فرد برای آنزیم های برشی • عدم تکثیر پلازمید Ti در باکتری های دیگر مانند E. coli
مراحل اصلاح پلازمید Ti • افزودن یک ژن مارکر گزینشگر جهت اعطای مقاومت به سلول های گیاهی ترنسفورم شده • افزودن یک ناحیه شروع همانند سازی (ori) به پلازمید جهت همانندسازی در E.coli • حفظ توالی مرزی راست T-DNA(جهت الحاق و پیوستن T-DNA به توالی DNA سلول گیاهی لازم است) • افزودن یک پلی لینکر (MCS) جهت تسهیل الحاق ژن کلون شده به ناحیه بین توالی های مرزی T-DNA
انواع ناقل با توجه به اینکه این ناقل های کلونینگ فاقد ژن های ناحیه Vir هستند، آنها قادر به انتقال و الحاق ناحیه T-DNA (ژن مورد نظر) به داخل سلول و کروموزوم سلول گیاه میزبان نمی باشند. بنابراین دو پلازمید Ti از سیستم ناقل مشتق شده توسعه پیدا کرده است. Co-integrate vectors Binary vectors
Co-integrate vectors به ناقلینی که از طریق همولوژی DNA، به درون یک پلازمید ساکن Ti باز ترکیب می شوند، ناقلین تلفیقی یا ناقلین مشترک می گویند.
اجزای ناقل تلفیقی (Co-integrate vectors) • مکان های مناسب برای جا دادن ژن مورد نظر (MCS) • ژن یا ژن های نشانگر گزینشگر آنتی بیوتیکی فعال در E. coliو A. tumefaciens • یک ژن نشانگر گزینشگر فعال در گیاه • نقطه شروع همانندسازی فعال در E.coliکه در آگروباکتریوم عمل نمی کند.
اجزای ناقل دوتایی (Binary vectors) • مکان کلونینگ چند گانه (MCS) • یک نقطه شروع همانند سازی با قابلیت عمل در طیف وسیعی از میزبان ها (مثل E.coli و A. tumefaciens) • نشانگرهای گزینشکر برای باکتری ها و گیاهان • توالی های مرزی T-DNA (هرچند فقط توالی مرزی سمت راست مطلقا ضروری است)
مزایای استفاده از ناقلین دوتایی • به پروسه های نوترکیبی در in vivoنیاز ندارند در حالیکه ناقلین تلفیقی برای ماندگاری دائم در درون نژاد آگروباکتریوم هدف، حتما به یک فرآیند نوترکیبی نیاز دارند. • به جای پلازمید بزرگ نوترکیب، از ناقل های کوچک استفاده می شود که سبب افزایش سرعت و راندمان انتقال می شود.
مهمترین لازمه ها برای انتقال ژن توسط آگروباکتریوم • تولید استوسیرینگون یا دیگر ترکیبات مرتبط با آن توسط ریز نمونه گیاهی یا تحریک باکتری توسط استوسیرینگون مصنوعی جهت فعال شدن ژنهای ناحیه vir • باززایی گیاهان کامل توسط سلول ها و بافت های مستعد برای ترانسفورماسیون
روش های تلقیح • آلوده سازی گیاهان زخمی • کشت توام • روش دیسکی برگی روش دیسکی از نظر تکنیکی ساده بوده و خیلی سریع گیاهان تراریخته تولید می کند. از این رو در حال حاضر استفاده از این روش ترجیح داده می شود.
آلودگی ویروس با استفاده از آگروباکتریوم • روش انتقالی توالی های ویروسی یا ویروئیدی به گیاهان به استفاده از آگروباکتریوم را Agroinfection یا Agroinoculation می نامند. امروزه مشخص شده که ژنوم های ویروسی گیاهی که در پلازمیدهای Ti کلون می شوند، می توانند از آگروباکتریوم به گیاه منتقل شوند و پس از انتقال، یک آلودگی ایده آل ایجاد نمایند. • به دلیل اینکه بعضی از ویروس ها به صورت مکانیکی منتقل نمی شوند و از طرفی مایه زنی مصنوعی ویروس با واسطه حشره ناقل نیز با مشکلاتی از جمله عدم یکنواختی در مایه زنی همراه است از این رو از این روش به صورت گسترده ای استفاده می شود. • این روش برای انتقال ویروس های مختلفی مانند کالیموویروسها، بادنا ویروسها، جمینی ویروسها و لتئوویروسها که محدود به آوند های آبکشی گیاهان هستند و ویروئیدها به کار رفته است.
مزایا • یک ابزار طبیعی برای انتقال ژن ها • توانایی آلوده سازی سلول ها و بافت های سالم و کمتر شدن مشکلات ناشی از محدودیت های کشت بافت • انتقال قطعات بزرگ DNAبا کارآیی زیاد • تلفیق DNA فرآیند دقیق • پایداری بالای ژن منتقل شده
معایب • محدودیت در دامنه میزبانی • مشکل بودن تراریخت نمودن سلول ها در بافت هایی که از توانایی باززایی برخوردارند
منابع Boultan, M.I. (1995). Agrobacterium mediated transfer of gminiviruses to plant tissues. Meth. Mol. Biol. 99: 77-93. Chawla, H.S. 2000. introduction to Plant Biotechnology. Science Publisher, Inc. USA. 368pps. Martin, J. H., Mifsud, D. & Rapisarda, C. (2000). The whiteflies (Hemiptera : Aleyrodidae) of Europe and the Mediterranean Basin. Bull.Entom. Res90: 407-448. Pico, B., Ferriol, M., Diez, M. J. & Vinals, F. N. (2001). Agroinoculation methods to screen wild Lycopersiconfor resistance to Tomato yellow leaf curl virus. J. Plant Pathol.83, 215-220. Rigden, J.E., Dry, I.B., Kruke, L.R. and Rezaian, M.A. (1996). Plant virus DNA replication processes in agrobacterium: insight into the origins on geminiviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10280-10284.
