Estrazione del DNA batterico

1. Estrazione del DNA batterico Centrifugazione della coltura batterica • Le cellule vengono trattate con lisozima che degrada la parete. La lisi cellulare si ottiene mediante differenti agenti chimico-fisici: • Calore • NaOH + SDS • Sonicazione

2. Trattamento con fenolo e/o fenolo-cloroformio per allontanare le proteine. In presenza di etanolo (70%) e Na+ i frammenti di DNA precipitano e possono essere raccolti mediante centrifugazione. In presenza di etanolo (70%) e Na+ il DNA cromosomale si arrotola sulla bacchetta di vetro.

3. I Plasmidi Molecole circolari che replicano indipendentemente dal cromosoma, DNA extracromosomiale. I plasmidi posseggono un propria origine di replicazione (ori). I plasmidi variano in dimensione da 1,5 kb a 200-300 kb. Il numero di copie per cellula può variare da 1-25 (low copy number) fino a >100 (high copy number). I plasmidi possono conferire differenti fenotipi: - resistenza e sintesi di antibiotici; - degradazione composti aromatici; - fermentazione di zuccheri; - sintesi di tossine; - sintesi di batteriocina; - induzione di tumori nelle piante; - sintesi sistemi restrizione-modificazione del DNA; - resistenza a metalli pesanti. I plasmidi possono essere coniugativi (geni tra) o non-coniugativi.

4. Replicazione di derivati di ColE1 - RNA II regolatore positivo della replicazione. - RNAI e Rop regolatori negativi della replicazione. Mutazioni nel gene rop o nel RNA I determinano un incremento del copy number

5. Replicazione di pSC101 L’ origine (ori) contiene da 3 a 7 copie di una specifica sequenza R (17-22 bp), detta iterone. RepA si lega ai box R1, R2, e R3. RepA si autoregola interagendo con le sequenze ripetute invertite IR1 e IR2 localizzate sul suo promotore. Iteroni RepA funziona da regolatore negativo (RepA è in grado di prevenire l’inizio della replicazione legandosi agli interoni di 2 plasmidi in modo da unirliinsieme e mutazioni a carico di questa proteina determinano un aumento del numero di copie per cellula del plasmide pSC101. pBR322 There are 40 enzymes with unique cleavage sites on pBR322 (4361 bp).  pos. 1 The pBR322 contains the ApR and TcR genes of RSF2124 (a ColE1 derivative carrying a transposon specifying amp resistance) and pSC101 respectively, combined with replication element of pMB1, a ColE1-like plasmid.

6. Features of many modern Plasmids • 1) Small size • 2) Origin of replication (e.g. ColE1, very high copy 500 copies per cell) • 3) Multiple cloning site (MCS) , often embedded in a LacZ report gene for ease of selecting inserts • 4) Selectable marker genes (antibiotic resistance) • 5) Some are expression vectors have sequences that allow RNA polymerase to transcribe genes • 6) DNA sequencing primers • 7) Over expression of the cloned protein or expression of fusion proteins Purification of Plasmids Takes advantage of distinct topological state of plasmids. - plasmids will be covalently closed, negatively wound circles when E. coli is lysed. - chromosomal DNA will be sheared into linear, non-topologically constrained fragments (because so big). This difference can be exploited to allow purification of plasmids: - difference in binding ethidium bromide, leading to different densities (CsCl banding – Radloff et al. 1967). - different rater of re-associate of two strands following denaturation by boiling or alkaline treatment.

7. Alkaline denaturation Birnboim & Doly (1979) Cells + Lisozyme NaOH + SDS  Na-Acetate pH 5.2  Ctg.  Supernatant + Phenol /chloroform  Aqueous phase + Et-OH  Ctg.  Ctg  Plasmid DNA pellet

8. Plasmid DNA purification by centrifugation on EtBr-CsCl gradient Less EtBr can bind to covalently closed circular DNA (CCC) than to a linear or nicked circular DNA. In fact a CCC DNA molecule as a plasmid has no free ends and can only unwind to limited extend, this limiting the amount of EtBr bound. Also, progressively EtBr higher concentrations shift DNA supercoiling from negative to positive. At 2 mg of EtBr per ml, most of DNAs are completely relaxed. The arrow indicates the free rotation of linear DNA. The density of DNA-EtBr complex decreases as more EtBr is bound

9. Ethidium bromide-caesium chloride density gradient centrifugation Isolating Plasmids by spin column • Load supernatant with plasmids onto spin column. • The pellet is washed with EtOH, causing the plasmid DNA to precipitate. • The plasmid DNA binds the resin in the spin column under high salt conditions. • Wash the column. • Finally, the purified plasmid DNA is eluted in water.

10. Quality and Quantity of Nucleic AcidsLegge di Beer-LambertA = εx l x C dove ε è detto coefficiente di assorbimento (estensione) molare C è la concentrazione molare della soluzione e l è il cammino ottico • Quantity: A260 = DNA 1 O.D. = 50 μg/ml DNA O.D. x 50 (μg/ml) x dilution factor = XX μg/ml • Quality:A280 = protein Purity = A260/A280 If ratio ≈ 1.6 - 1.8, then assume it is a good prep. If ratio > 2, then there is RNA contamination. If ratio < 1.6, then there is protein contamination. 1 O.D. = 40 μg/ml RNA 1 O.D. = 33 μg/ml oligonucleotide

11. Trasformazione cellule batteriche Metodo del Calcio cloruro. Il CaCl2 forse provoca la precipitazione del DNA sulla cellula batterica o modifica la parete migliorando il legame del DNA. Espressione geni plasmidici (37°C) Elettroporazione L'elettroporazione è una tecnica per introdurre il DNA nelle cellule applicata a protoplasti e funziona anche con le cellule animali, batteri e lieviti. L'elettroporazione consiste in una repentina scarica elettrica (millisecondi) operata in un piccolissimo contenitore che racchiude protoplasti vegetali e molecole di DNA in una sospensione liquida. La scarica apre simultaneamente la membrana plasmatica in numerosi punti (pori), permettendo alle molecole di DNA di penetrare nella cellula.

12. Construction and identification of recombinant pBR322 plasmids

13. Screening by replica plating 1) Master plate containing tet only 2) Replica plating on plates containing tet + amp 3) Cells on the replica plate are allowed to grow into colonies. Any colony present on the master plate but missing from the replica plate carries a recombinant pBR322 with DNA inserted within amp gene

14. pUC19 The polylinker encodes for 18 additional amino acids that do not eliminate the function of b-galactosidase Cloning  Transformation (lacZ- strain)  Selection on plates containing amp + IPTG + X-gal Blue colonies  active -gal  no insert White colonies  inactive -gal  insertion of foreign DNA

15. galattosio glucosio Lattosio = 4-O-(-galattopiranosil)-D-glucopiranosio enzima  -galattosidasi lattosio galattosio + glucosio IPTG Isopropyl- -D-thyiogalactospyranoside Gratuitous inducer  è utilizzato per indurre l’attività del lac operon poiché si lega e inattiva il repressore lac, senza essere degradato dall’enzima X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactopyranoside Substrato cromogenico; a seguito dell’azione enzimatica produce un precipitato di colore blu-indaco cleavage

16. Expression vectors Located 5-10 nucleotides upstream the AUG [5’-UAAGGAGG-3’] It should take into consideration problems related to codon usage pPLa2311 vector Foreign DNA is cloned into EcoRI under the control of l PL promoter. Ampicillin sensitivity can be used for screening of positive clones. The vector is inserted into an E. coli strain that carries on the chromosome a temperature sensitive cI gene. At 32°C  cI gene is active and produces l repressor At 42°C  inactivation of cI and expression of the inserted gene Standard protocol Grow cells at 30°C  Shift the cells at 42°C for 10 min  Grow the cells at 37°C for 30 min  Collect the cells and start protein purification

17. Overproduction of a toxic gene (hns) After deletion of its own promoter the hns gene is cloned into the pPLc2833 vector which is used to transform an E. coli strain, carrying on the chromosome a mutated (Ts) cI gene. H-NS overproduction is checked by PAGE-SDS C 1 2 3 M C = crude extract of uninduced cells 1-3 = different aliquots of crude extract of induced cells M = protein marker H-NS Induced cells Control sample (uninduced cells growing at 30°C) Time (min)

18. Vettori pET • Il gene dell’RNA pol. di T7 (gene 1) viene inserito su cromosoma di E. coli sotto il controllo del promotore lac. • Il gene di interesse è clonato su vettore pET sotto il controllo del promotore di T7. • L’induzione si ottiene fornendo IPTG (analogo dell’allolattosio) che legandosi al repressore LacI fa sicché quest’ultimo non riconosca l’operatore lacO. • Il gene lacI è inserito sul cromosoma di E. coli. • Il lisozima di T7, codificato dal plasmide pLysS, è in grado di legarsi alle rare molecole di RNA pol. di T7 prodotte in assenza di induzione e di inattivarle. • La presenza dell’operatore lacO tra il promotore di T7 ed il gene clonato consente di ridurre ulteriormente l’espressione (ad es. gene tossico) in assenza di IPTG.

19. Glutathione-S-Transferase fusion protein (1988) Factor X Thrombin IPTG induction using DE3 strain lac promoter GST fusion protein is purified under non-denaturating conditions by adsorption to glutathione-agarose column which is subsequently eluted with glutathione. His-tag expression vector (pBAD/His plasmid) PBAD arabinose inducible promoter EK site Enterokinase cleavage site (Asp4-Lys) A,B,C  MCS in all 3 reading frames Epitope  antibody recognition araC  repressor

20. Repressione Regolazione del promotore pBAD Cambiamenti conformazionali a carico del repressore AraC in seguito alla presenza di arabinosio determinano l’attivazione del promotore pBAD Attivazione Purificazione della proteina ricombinante La coda di istidine si lega alla colonna che contiene ioni nichel immobilizzati CL e FT  Proteine che non si legano alla resina. W1-W5  Lavaggi con bassa concentrazione di imidazolo. E1-E2  Eluizione con elevata concentrazione di imidazolo.  Proteina purificata

21. Vector for promoter analysis pKK 232.8 is a vector harbouring the promoterless catgene (reporter gene). The cat gene encodes the enzyme chloroamphenicol acetyl transferase. Cat expression  phenotype camr Functional promoter is cloned into polylinker of pKK232.8 Selection of transformed cells on plate LB+cam Crude cellular extracts CAT assay

22. CAT Assay 1= reaction performed without crude extract 2= mix containing the different products derived from the acetylation reaction 3-12= samples TLC = chloroform: methanol (19:1)