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第 32 章 RNA 的生物合成与加工

第 32 章 RNA 的生物合成与加工. 转录产物有 mRNA 、 tRNA 、 rRNA 。. 原核细胞的 mRNA 为单顺反子或多顺反子。. 真核细胞的 mRNA 为单顺反子。. 有义链，编码链；反义链，模板链. E.coli 的 RNA 聚合酶中， α 2 ββ ′ 称为核心酶。. σ 因子辨认模板 DNA 的起始位点。. 基因的转录 – mRNA 的合成. 基因转录是以 DNA 为模板合成与其碱基顺序互补的 mRNA 的过程。

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第 32 章 RNA 的生物合成与加工

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Presentation Transcript

  1. 第32章 RNA的生物合成与加工 转录产物有mRNA、tRNA、rRNA。 原核细胞的mRNA为单顺反子或多顺反子。 真核细胞的mRNA为单顺反子。 有义链，编码链；反义链，模板链 E.coli 的RNA聚合酶中，α2ββ′称为核心酶。 σ因子辨认模板DNA的起始位点。

  2. 基因的转录 – mRNA的合成 • 基因转录是以DNA为模板合成与其碱基顺序互补的mRNA的过程。 • 细胞生长周期的某个阶段，DNA双螺旋解开成为转录模板，在RNA聚合酶催化下，合成mRNA。mRNA不能自我复制，即其本身不能作为复制模板，因此在转录过程中即使出现某些差错，也不会遗传下去。

  3. ● 按A U，C G配对的原则，合成RNA分子 若 干 基 本 概 念 ●基因表达的第一步 ●以D. S. DNA中的一条单链作为转录的模板 ● 在依赖DNA的RNA聚合酶的作用下 ● 模板单链 DNA的极性方向为3’ → 5’, 而非模板单链 DNA的极性方向与RNA链相同，均为5’ → 3’. (书写DNA序列时，仅写非模板序列，可不注明极性方向) DNA 5’---ATGAGTA----3’ Non-template (sense strand) 3’----TACTCAT----5’ template (antisense strand) RNA 5’----AUGAGUA----3’

  4. -10 +1 +10 upstream start point downstream ● 某一基因只以一条单链DNA 为模板进行转录（不对称转录） ● RNA的转录包括promotion, elongation, termination 三过程 ● 从启动子（promoter）到终止子（terminator）称为转录单位（transcriptional unit） ● 原核生物中的转录单位多为 polycistron in operon 真核生物中的转录单位多为monocistron, No operon ● 转录原点记为+1，其上游记为负值，下游记为正值

  5. 转录过程

  6. mRNA合成

  7. 注意：RNA聚合酶与启动子结合启始转录 RNA的合成从5，到3，模板是3，到5， 只有一条DNA链可以转录 转录后DNA恢复双链结构

  8. 体外，两条DNA均可转录 DNA以全保留的方式转录 核心酶可以延伸，δ因子启始合成、识别启动子 转录速度比复制慢，与翻译速度相近 δ因子的存在影响核心酶的构象： 降低了酶与DNA的结合常数与停留时间 增加了与启动子的结合常数和停留时间 起始后δ因子脱离，RNA延伸 不同的δ因子识别不同类型的启动子

  9. 转录过程的选择性抑制 放线菌素D是原核和真核细胞RNA聚合酶的专一抑制剂。 利福平是原核细胞RNA聚合酶的抑制剂。 α-鹅膏蕈碱是真核细胞RNA聚合酶的抑制剂。

  10. 第一节 RNA转录合成的特点 一、转录的不对称性 转录(transcription)的不对称性就是指以双链DNA中的一条链作为模板进行转录，从而将遗传信息由DNA传递给RNA。

  11. 对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链），而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。对于不同的基因来说，其转录信息可以存在于两条不同的DNA链上。能够转录RNA的那条DNA链称为有意义链(模板链），而与之互补的另一条DNA链称为反意义链（编码链）。 有意义链 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 反意义链

  12. 二、转录的连续性 RNA转录合成时，以DNA作为模板，在RNA聚合酶的催化下，连续合成一段RNA链，各条RNA链之间无需再进行连接。 合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信息，则称为多顺反子。

  13. 三、转录的单向性 RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板DNA链的方向为3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。

  14. 四、有特定的起始和终止位点 RNA转录合成时，只能以DNA分子中的某一段作为模板，故存在特定的起始位点和特定的终止位点，特定起始点和特定终止点之间的DNA链构成一个转录单位，通常由转录区和有关的调节顺序构成。

  15. 第二节 RNA转录合成的条件 一、底物 四种核糖核苷酸，即ATP，GTP，CTP，UTP。 二、模板 以一段单链DNA作为模板。

  16. 三、RNA聚合酶 这是一种不同于引物酶的依赖DNA的RNA聚合酶。该酶在单链DNA模板以及四种核糖核苷酸存在的条件下，不需要引物，即可从5'→3'聚合RNA。

  17. 原核生物中的RNA聚合酶全酶由五个亚基构成，即α2ββ'σ。 σ亚基与转录起始点的识别有关，而在转录合成开始后被释放，余下的部分（α2ββ'）被称为核心酶，与RNA链的聚合有关。

  18. 大肠杆菌RNA聚合酶全酶 Rifampin是RNA合成起始的抑制剂

  19. 真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。真核生物中的RNA聚合酶可按其对α-鹅膏蕈碱敏感性而分为三种，它们均由10～12个大小不同的亚基所组成，结构非常复杂，其功能也不同。

  20. 酵母RNA聚合酶Ⅰ和Ⅱ

  21. 四、终止因子 1．ρ蛋白：这是一种六聚体的蛋白质，亚基的分子量为50kd。该蛋白因子能识别终止信号，并能与RNA紧密结合，导致RNA的释放。 2．nusA蛋白：为一分子量69kd的酸性蛋白，它能与RNA及RNA聚合酶相结合，在终止部位使两者被释放。

  22. ★ After initiation → substituting δ → NusA + core E NusA protein ; (antiterminationN protein utilization substance) ★69 Kd, acid protein ★ RNApol-attaching factor ★Impel RNApol. pausing in terminator for 1’-15’ and waiting for Rho factor to stop transcription of RNA

  23. 五、激活因子 目前已知激活因子为降解产物基因激活蛋白（CAP），又称为cAMP受体蛋白（CRP）。是一种二聚体蛋白质，亚基分子量为23kd。该蛋白与cAMP结合后，刺激RNA聚合酶与起始部位结合，从而起始转录过程。

  24. 第三节 RNA转录合成的基本过程 一、识别 原核生物RNA聚合酶中的σ因子识别转录起始点，并促使核心酶结合形成全酶复合物。 被辨认的区段就是位于转录起始点-35区的TTGACA序列。 RNA聚合酶识别 酶与该区结合后，即滑动至-10区的TATAAT序列（Pribnow盒），并启动转录。有利于DNA局部解开双链

  25. 原核生物中转录起始区的共同序列

  26. R -35 B-10 I +1 Initiation Sextama Box Pribnow Box

  27. 位于基因上游，与RNA聚合酶识别、结合并起始转录有关的一些DNA顺序称为启动子（promoter)。 • 转录起始的第一个核苷酸是pppG或pppA

  28. Sextama Box ; -35 site RNApol. loosely binding site RNApol. recognition site (R site) TTGAC (Sextama Box) Pribnow Box ; -10 site RNApol. firmly binding site (B site) TATAAT (pribnow Box) Initiation site ; +1 RNA transcriptional startpoint (I site) A/G Core promoter region including -35 (R) -10 (B) +1 (I) RNA

  29. lSextama Box 与Pribnow Box 间距17bp, 有利于RNApol启动 间距趋近于17 bp，up mutation 间距远离于17 bp，down mutation 17bp的间距较17bp的序列对转录更为重要 lSextama Box or Pribnow Box mut. →转录率下降100X Sextama Box and Pribnow Box mut. →转录率下降1000X

  30. δ因子； ★ 重复使用(Re-usable) ★ 使 Holo-enzyme识别Sextama Box, 与模板链结合 ★ 修饰 RNApol 构型， 降低全酶与DNA的非专一性结合力（107/mol） 增强全酶与R, B site的专一性结合力(1014/mol) 导致RNA链的延伸缓慢

  31. Promoter与δfactor 间的结合专效性 ● 决定了strong promoter & weak promoter ★ 启动子中-35, -10 区序列的差异影响与RNApol 中 δ因子的结合能力 ★ 不同启动子的-35，-10区序列间存在较为 保守的标准序列( 标准启动子 ) δfactor is responsible for recognition of consensus sequence of promoter and only required for initiation.

  32. 真核生物的转录起始区上游也存在一段富含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒。真核生物的转录起始区上游也存在一段富含TA的顺序，被称为Hogness盒或TATA盒。 • 除此之外，在真核生物中还可见到其他带共性的序列，如CAAT盒及GC盒等。

  33. Initiation region PyPyANT/(A)PyPy 1-4Kb -70 -30 +1 GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor) Promoter for basic transcription ( class II recognized by RNA polymerase II ) lCap site ; initiation point (+1) Capping m7GpppA/G------70 ±---AUG---(in mRNA)

  34. 1-4Kb -70 -30 +1 GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor) Promoter for basic transcription lTATA box / Hogness box / Goldberg-Hogness box (-30) Rich AT and rich GC flanked rich GC------T A T A A (T) A A (T)------rich GC 82 97 93 85 63 (37) 83 50 (37)

  35. 1-4Kb -70 -30 +1 GC island CAAC/T box TATA box Cap Enhancer UPE core promoter Promoter (basic factor) Promoter for basic transcription lGC island (C no methylated) and CAAT box (CAT box UPE) (-70) GCGC-----GGC(T)CAATCT---- Response to effect of transcription Range 30 bp±

  36. lPromoter functions CAAT box (modulator) controlling transcriptional efficiency (cause GC island) TATA box (selector) controlling starting point and efficiency I site (initiator)determination initiation point and capping of mRNA

  37. 真核生物的转录起始较为复杂。目前已知RNA聚合酶Ⅱ至少有六种不同的蛋白因子参与转录复合体的形成。这些蛋白因子被称为转录因子（trans-criptional factor, TF)。包括 TFⅡA，TFⅡB，TFⅡD，TFⅡE，TFⅡF，TFⅡ-I。

  38. Special box Arabidopsis I box (GATAAG)----5-20--------G box ------ Pea H box (CCTACC)----5-20--------G box ------ modul Cis-factor for inducible expression lInducible expressed by environment HSE ( Heat Shock Element ) GRE ( Glucocoricoid Response Element ) 糖皮质激素应激元件 MRE ( Metal Response Element ) TSE ( Tissue Special Element ) Ig ATGGAAAT + Oct-2 factor →B 细胞表达 GH ATGAATAT + Pit-1 factor → 脑下垂体表达

  39. Enhancer Promoter No for special gene only for special gene lEnhancer Chambon discovered the first enhancer in the 5'-flanking region of the SV40 early gene. ★ Enhancer与Promoter的比较 Enhance expression Basic expression Position not be fixed isolated region Bi-directional element Mono-directional element

  40. 促进转录的复合体+ UPE + core promoter 基本转录复合体 ★ Enhancer 的结构与功能 ----Enhancer 由两个以上的增强子成分(Enhancer Element)组成 ----Enhancer Element 必需由两个紧密相连,具有间距效应的 增强子元(Enhanson）组成 ----各个Enhanson(cis-factor)与激活蛋白(trans-factor)结合 增强特异性转录

  41. En. Elem. En. Elem En. Elem. -250 -180 coreC TCII TCI sphII sphI Ap3 Ap2 Ap1 基本转录复合体 促进转录复合体 mRNA GC CAAT TATA +1 e.g. SV40 Enhancer (-179~ -250) 远距离控制，无方向性

  42. 3# HML MAT HMR Silencer Mating type (MAT) of yeast Silencer can act at a distance (at least 1 kb away) to modulate transcription somehow cause the chromatin to coil up into a condensed Inaccessible Inactive form thereby preventing transcription of neighboring genes

  43. 真核生物RNA聚合酶Ⅱ转录因子及其功能 转录因子 功 能 TFⅡA 稳定TFⅡD结合 TFⅡB 促进pol Ⅱ结合 TFⅡD 辨认TATA盒 TFⅡE ATPase TFⅡF 解旋酶

  44. Cis-factor + TIC (Transcriptional Initiate Complex) 与基本转录相关的trans-factor 真核生物中RNApol的作用必须有其他相关转录蛋白在启动子处的先期结合才能启动转录 Trans-factor for basic transcription lTF (I, II, III) Transcriptional Factor lTBP (TATA box Binding Protein) lTAF (TBP Associate Factor) lRAP (RNApol. Associate protein)

  45. RNApol II (B); ---For pre-mRNA transcription ---Located in nucleoplasm ---L’ maximum subunit 240 kd & have specific COOH-end namedCTD ( Carboxyl Terminal Domain ) only in RNApol II ---CTD-end; 7aa repeats & high frequency phosphorylation Tyr—SerP—Pro—ThrP—SerP—Pro—SerP

  46. 使RNApol易于离开Promoter 转录延伸 Yeast 26X Drosophila 44X repeat unit of 7 aa / in CTD Rat & Human 52X ---依CTD中，Ser,Thr 磷酸化与否，将L’分为3个Subforms IIO(240kd) IIA (220kd)IIB (180kd) 高度磷酸化 CTD over-phosphorylated 基本形式 Initially binds to promoter 蛋白酶水解 Non-physiological form 提高转录效率10X IIA

  47. ---RNApol II + >20TFIIs 逐级组装TIC → 转录启动 (Transcriptional Initiation Complex) TFIID; A sort of protein complex (TBP & > 8 TAF) (TBP); needed for RNApol I, II, III Very high conserved C-end domain of 180 aa Binds with DNA in minor groove & wilds it Determinationinitiation starting site Control UPE effect for basic transcription

  48. E H B D A mRNA Promoter clearance F Transcription starting

  49. TATA +1 TFII A TBP of D TFII F RNApol II TFII B conclusion pre-TIC Wilds minor groove Basic TIC

  50. E H E H B D A mRNA complete TIC Promoter clearance Transcription starting

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