天然药物化学成分提取分离方法

1. 天然药物化学成分提取分离方法

2. 化学成分提取分离方法 • 天然药物化学研究常从有效成分或生理活性成分的提取、分离工作开始。在进行提取之前，应了解所用材料的基源（如动、植物的学名）、产地、药用部位、采集时间与方法等。 • 目的物为已知成分或已知化学结构类型，如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄碱，或从植物中提取某类成分如总生物碱或总酸性成分时，工作比较简单。一般宜先查阅有关资料，搜集比较该种或该类成分的各种提取方案，尤其是工业生产方法，在根据具体条件加以选用。 • 从中草药或天然药物中寻找未知有效成分或有效部位时，情况就比较复杂。只能根据预先确定的目标，在适当的活性测试体系指导下，进行提取、分离并以相应的动物模型筛选、临床验证、反复实践，才能达到目的。

3. 一、有效成分的提取 ㈠ 溶剂提取法 ㈡ 水蒸气蒸馏法 ㈢ 升华法

4. ㈠ 溶剂提取法 • 溶剂提取法系选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。 • 天然药物中的化学成分在溶剂中的溶解度直接与溶剂性质有关。溶剂可分为水、亲水性有机溶剂和亲脂性有机溶剂。一些常见溶剂的脂性的强弱顺序如下： • 石油醚>苯>氯仿>乙醚>乙酸乙酯>丙酮>乙醇>甲醇>水 • 天然药物化学成分可通过结构估计它们的极性。

5. ㈠ 溶剂提取法 • 甙类的分子中结合有糖分子，羟基数目多，能表现强亲水性，而甙元则属于亲脂性化合物，而生物碱盐，能够离子化，加大了极性，就变成了亲水性化合物。鞣质是多羟基衍生物，列为亲水性化合物。油脂、挥发油、蜡、脂溶性色素都是强亲脂性成分。 • 萜类、甾体等脂环类及芳香类化合物因为极性较小，易溶于氯仿、乙醚等亲脂性溶剂中； • 糖苷、氨基酸等成分极性较大，易溶于水及含水醇中； • 酸性、碱性及两性化合物，因为存在状态（分子或离子形式）随溶液而异，故溶解度将随pH而改变。

6. ㈠ 溶剂提取法 • 只要中草药成分的亲水性和亲脂性与溶剂的此项性质相当，就会在其中有较大的溶解度，即所谓“相似相溶”的规律。这是选择适当溶剂自中草药中提取所需要成分的依据之一。

7. ㈡ 水蒸气蒸馏法 • 水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性、能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。天然药物中的挥发油、某些小分子生物碱如麻黄碱、烟碱、槟榔碱以及某些小分子的酚性物质如牡丹酚等的提取可采用水蒸气蒸馏法。

8. ㈢ 升华法 • 某些固体物质如水杨酸、苯甲酸、樟脑等受热在低于其熔点的温度下，不经过熔化就可直接转化为蒸气，蒸气遇冷后又凝结成固体称为升华。天然药物中有一些成分具有升华性质，能利用升华法直接中药材中提取出来。但天然药物成分一般可升华的很少。

9. 二、有效成分的分离与精制

10. 化学成分分离精制常用方法原理 ㈠ 根据物质溶解度差别进行分离 ㈡ 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 ㈢ 根据物质的吸附性差别进行分离 ㈣ 根据物质分子大小差异进行分离

11. ㈠ 根据物质溶解度差别进行分离 1、利用温度不同引起溶解度的改变 2、改变混合溶剂的极性 3、调节溶液的pH值，改变分子的存在状态 4、沉淀法 5、盐析法

12. 1、利用温度不同引起溶解度的改变 • 鉴定中草药化学成分，研究其化学结构，必须首先将中草药成分制备成单体纯品。中草药化学成分在常温下多半是固体的物质，常具有结晶性的通性，可以根据溶解度的不同用结晶法来达到分离精制的目的。 • 中草药化学成分，一旦获得结晶，就能有效地进一步精制成为单体纯品。纯化合物的结晶有一定的熔点和结晶学的特征，有利于鉴定。因此，求得结晶并制备成单体纯品，就成为鉴定中草药成分、研究其分子结构重要的一步。

13. 1、利用温度不同引起溶解度的改变 • 结晶法是选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，趁热过滤除去不溶的杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶，由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。

14. ⑴ 杂质的除去 • 结晶法所用的样品必须是已经用其它方法提得比较纯的时候才能采用此法精制。 • 结晶乃同类分子自相排列，如果杂质过多，则阻碍分子的排列。如果粗提取部分的纯度很差则很难得到结晶。

15. ⑴ 杂质的除去 ① 用溶剂溶出杂质，或只溶出所需要的成分。 ② 用少量活性炭等进行脱色处理，以除去有色杂质。 ③ 通过氧化铝、硅胶柱色谱处理（注意所需要的成分也可能被吸附而损失）。 ④ 制备其晶态的衍生物（如游离生物碱可制备各种生物碱盐类，羟基化合物可转变成乙酰化物，碳基化合物可制备成苯腙衍生物结晶）。

16. ⑵ 溶剂的选择 • 适宜的溶剂是在冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大。溶剂的沸点亦不宜太高。一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。 • 有些化合物在一般溶剂中不易形成结晶，而在某些溶剂中则易于形成结晶。例如葛根素、逆没食子酸（ellagicacid）在冰醋酸中易形成结晶，大黄素）在吡啶中易于结晶，萱草毒素在DMF中易得到结晶，而穿心莲亚硫酸氢钠加成物在丙酮一水中较易得到结晶。又如蝙蝠葛碱通常为无定形粉未，但能和氯仿或乙醚形成为加成物结晶。

17. ⑶ 结晶溶液的制备 • 制备结晶的溶液为过饱和的溶液。一般是应用适量的溶剂在加温的情况下，将化合物溶解再放置冷处。如果在室温中可以析出结晶，就不一定放置于冰箱中，以免伴随结晶析出更多的杂质。 • 无定形的粉未状物质，远较晶体物质的溶解度大，易于形成过饱和溶液。一般经过精制的化合物，在蒸去溶剂抽松为无定形粉未，加入少量溶剂，往往立即可以溶解，稍稍放置即能析出结晶。例如长春花总弱碱部分抽松后加入1.5倍量的甲醇溶解，放置后很快析出长春碱结晶。又如蝙蝠葛碱在乙醚中很难溶解，但当其盐的水溶液用氨液碱化，并立即用乙醚萃取，所得的乙醚溶液，放置后即可析出蝙蝠葛碱的乙醚加成物结晶。

18. ⑶结晶溶液的制备 • 制备结晶溶液，除用单一溶剂外，也常采用混合溶剂。 • 一般是先将化合物溶于易溶的溶剂中，再在室温下滴加适量的难溶的溶剂，直至溶液微呈浑浊，并将此溶液微微加温，使溶液完全澄清后放置。 • β一细辛醚重结晶时，可先溶于乙醇，再滴加适量水，即可析出很好的结晶。 • 虎杖中提取水溶性的虎杖甙时，在已精制饱和的水溶液上添加一层乙醚放置，既有利于溶出其共存的脂溶性杂质，又可降低水的极性，促使虎杖甙的结晶化。

19. (4) 结晶纯度的判定 • 结晶的纯度可由化合物的晶形、色泽、熔点和熔距、薄层色谱或纸色谱等作初步鉴定。 • 一个单体纯化合物一般都有一定的熔点和较小的熔距，同时在薄层色谱或纸色谱中经数种不同展开剂系统检定，也为一个斑点者，一般可以认为是一个单体化合物。

20. ⑹ 结晶纯度的判定 • 注意，有的化合物在一般层析条件下，虽然只呈现一个斑点，但并不一定是单体成分。例如鹿含草中主成分为高熊果甙、异高熊果甙极难用一般方法分离，经反复结晶后，在纸层及聚酞胺薄层上都只有一个斑点，易误认为单一成分，但测其熔点在115～125℃，熔距很长。经制备其甲醚后，再经纸层层析检定，可以出现两个斑点，异高熊果甙的比移值大于高熊果甙。 • HPLC是近年来可以用作判断有效成分纯度的一种重要手段。 • 此外，GC、UV光谱等，均有助于检识结晶样品的纯度。

21. 单晶的结构测定 • 单晶X射线衍射 单晶X射线分析是提供晶态下分子三维结构，确定分子的立体结构（构型、构象等）的最有效方法。

22. 在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。 在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇，以沉淀除去多糖、蛋白质等水溶性杂质（水/醇法）； 在浓缩乙醇提取液中加入数倍两量水稀释，放置以沉淀除去 树脂、叶绿素等水不溶性杂质（醇/水法）； 在乙醇浓缩液中加数倍两乙醚（醇/醚法）或丙酮（醇/丙酮法），可使皂苷沉淀析出，而脂溶性的树脂等类杂质则留在母液中。 2、改变混合溶剂的极性

23. 3、加酸碱调节溶液的pH值 对酸性、碱性或两性有机化合物来说，常可通过加入酸、碱以调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。 • 内酯类化合物不溶于水，但遇碱开环生成羧酸盐溶于水，再加酸酸化，又重新形成内酯环从溶液中析出，从而与其它杂质分离（碱/酸法）； • 生物碱一般不溶于水，遇酸生成生物碱盐而溶于水，再加碱碱化，又重新生成游离生物碱（酸/碱法）。这些化合物可以利用与水不相混溶的有机溶剂进行萃取分离。 • 可以分为强酸性、弱酸性和酚性三种，它们分别溶于碳酸氢钠、碳酸钠和氢氧化钠，借此可进行分离。

24. 4、沉淀法 • 在中草药提取液中加入某些试剂使产生沉淀，以获得有效成分或除去杂质的方法。 ⑴ 铅盐沉淀法 ⑵ 试剂沉淀法

25. ⑴ 铅盐沉淀法 铅盐沉淀法为分离某些中草药成分的经典方法之一。 • 醋酸铅及碱式醋酸铅，能与多种化学成分生成难溶的铅盐或络盐沉淀，故可利用这种性质使有效成分与杂质分离。 • 中性醋酸铅可与酸性物质或某些酚性物质结合成不溶性铅盐。因此，常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。 • 与碱式醋酸铅产生不溶性铅盐或络合物的范围更广。

26. ⑵ 试剂沉淀法 • 在生物碱盐的溶液中，加入某些生物碱沉淀试剂（见生物碱性质下），则生物碱生成不溶性复盐而析出。水溶性生物碱难以用萃取法提取分出，常加入雷氏铵盐使生成生物碱雷氏盐沉淀析出 • 用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质；胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。

27. 5、盐析法 盐析法是在中草药的水提液中、加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出，而与水溶性大的杂质分离。 • 盐析用的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。 • 三七的水提取液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂甙乙即可沉淀析出，自黄藤中提取掌叶防己碱，自三颗针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠或硫酸铵盐析制备。有些成分如原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在提取时，亦往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。

28. ㈡ 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 • 分配系数（K） 两种相互不能任意混溶的溶剂（如氯仿与水）如置分液漏斗中充分振摇，放置后即可分成两相。此时如果其中含有溶质，则溶质在两相溶剂中的分配比（K）在一定温度及压力下为一常数，可以下式表示： K=CU/CL • K：分配系数；CU：溶质在上相溶剂中的浓度；CL：溶质在下相溶剂中的浓度。

29. ㈡ 根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 1、液-液萃取法 2、逆流连续萃取法 3、逆流分配法（CounterCurrent Distribution，CCD） 4、液滴逆流色谱法（DCCC） 5、高速逆流色谱法（HSCCC） 6、气液分配色谱（GC或GLC） 7、液-液分配色谱（LC或LLC）

30. 1、液-液萃取法 • 利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的方法。 • 萃取时如果各成分的分配系数相差越大，分离效率越高。 • 水提取液中的有效成分是亲脂性的物质，一般多用亲脂性有机溶剂，如苯、氯仿或乙醚进行两相萃取；有效成分是偏于亲水性的物质，需用弱亲脂性的溶剂，例如乙酸乙酯、丁醇等。 • 提取黄酮类成分多用乙酸乙脂和水的两相萃取。提取亲水性强的皂甙则多选用正丁醇、异戊醇和水作两相萃取。

31. 液-液萃取法操作注意事项 ⑴ 先用小试管猛烈振摇约1分钟，观察萃取后二液层分层现象。如果容易产生乳化，大量提取时要避免猛烈振摇，可延长萃取时间。如碰到乳化现象，可将乳化层分出，再用新溶剂萃取；或将乳化层抽滤，或将乳化层稍稍加热；或较长时间放置并不时旋转，令其自然分层。乳化现象较严重时，可以采用二相溶剂逆流连续萃取装置。 ⑵ 水提取液的浓度最好在比重1.1～1.2之间，过稀则溶剂用量太大，影响操作。

32. 2、高速逆流色谱 (High-speed Countercurrent Chromatography，HSCCC) • 大多数色谱法都需要有固相载体某种形式的选择性吸附作用。在应用固相载体色谱分离中，往往会存在不同程度的不可逆吸附，造成被分离样品的损失，尤其在分离微量样品时受到限制。 • 高速逆流色谱，是近十年迅速发展起来的新型液—液分配色谱技术。与其它液相色谱分离方法相比．它不使用固相载体作固定相，被分离物质在互不相溶两相分配分离，克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。且花费溶剂少，分辨率高，可进行纯品制备。利用HSCCC，中草药粗提物的分离纯化制备可同步完成，被分离物可定量回收。

33. ⑴ HSCCC的工作原理 • 两种互不相溶的溶剂在聚四氟乙烯管内作高速行星运转，其中一相溶剂作固定相，用恒流泵输送载有样品的另一相溶剂穿过固定相，两相溶剂在螺旋管中实现高效的接触、混合、分配和传递。由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在聚四氟乙烯管中移动的速度也不同，从而使样品中各组分得到分离。

34. ⑵ HSCCC的特点 1、 应用范围广，适应性好由于溶剂系统的组成与配比可以是无限多，因而HSCCC适用于任何极性范围的品的分离，特别适用于分离极性大的组分以及一些生物大分子。 2、 操作简便，容易掌握对样品的预处理要求低，一般的粗提物即可进行HSCCC的制备分离或分析。

35. ⑵ HSCCC的特点 3、回收率高 固定相为液体，无需固体作载体，克服气、液相色谱使用固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。 4、重现性好 分离过程稳定、峰的保留相对标准偏差小于2％，

36. ⑵ HSCCC的特点 5、分离效率高，分离量较大与一般色谱的分离方式不同，能实现梯度操作和反相操作、亦能进行重复进样，特别适用于制备性分离，产品纯度高，制备量大，溶剂消耗少。 • 较大的制备型HSCCC，柱容积可达530ml，一次最多进样可达20g粗品；较小的分析型的HSCCC柱容积为8mL，进样量为几十微克，最大转速可达4000r／min.因此，被广泛地应用于植物化学成分的分离制备研究。

37. ⑵ HSCCC的特点 • 根据以上特点，HSCCC适合于中药成分的分离和分析。目前高速逆流色谱仪已成功地开发出分析型和制备型两大系列。制备或半制备HSCCC的特点是高流速、高浓度，不但适用于非极性化合物的分离，也适用于极性化合物的分离。在制备分离方面，可用于中药粗提物中各组分的分离，也可进一步精制，甚至直接从从粗提物—步纯化到纯品，来制备中药化学成分标准品。

38. ⑵ HSCCC的应用 • HSCCC的分离效率与气相色谱和高效液相色谱等技术相比较，前者不适宜用它完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而其对于样品的预处理条件较放松及回收率高，制备量大，特别适用于特定部位和特定组分的分离纯化与制备。

39. ⑶ HSCCC的应用 • 制备中药化学对照品 • 中草药化学对照品应具有高度均匀性，量值准确性和良好稳定性，其纯度要求很高。制备型HPLC曾是国外常用的主要手段。但是其设备和载体填料价格很高．对样品前期处理要求严格，存在不可逆吸附，溶剂用量大的缺点。因此致力于HSCCC分离、统化、制备中草药有效成分对照品的研究和产业化，具有现实意义。 • 从银杏叶中制备异鼠李素、山奈酚、槲皮索、白果内酯和橙皮甙；从大黄制备大黄羟基蒽醌甙元；从洋地黄叶中制备洋地黄毒甙；从虎杖中分离提纯白藜芦醇和白藜芦醇甙等。

40. 3、高效液相色谱(HPLC) • HPLC是在经典液相色谱基础上引入气相色谱的塔板理论，并采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，具有分析速度快、分离效率高和操作自动化特点的一种色谱技术。 • HPLC特别适合高沸点、大分子和热稳定性差的化合物的分离分析。中药的成分非常复杂，以往常用的薄层色谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足中药现代化发展的需要。高效液相色谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要的分析方法。常用于中药质量的控制、天然药物化学成分的分离及分析测定等。

41. 3、高效液相色谱(HPLC) • 检测器是液相色谱的三大关键部件（高压输液泵、高效色谱柱和检测器）之一。其发展在某种意义上决定着HPLC技术的进步。理想的检测器应具有以下特点： ⑴ 灵敏度高； ⑵ 对温度变化和流量波动不敏感； ⑶ 死体积小，不使峰额外地扩展； ⑷ 对溶剂无响应，能用于梯度洗脱操作 ⑸ 线性范围宽； ⑹ 对所有样品都有响应； ⑺ 对样品无破坏性。

42. 3、高效液相色谱(HPLC) • 检测器的种类繁多，至今还没有一种检测器可以同时满足以上几点要求。有紫外—可见分光检测器、荧光检测器、示差折光检测器、电化学检测器、二极管阵列检测器、测定大分子绝对分子量的多角度激光光散射仪。另外还有蒸发光检测器、化学发光检测器、手性检测器(旋光检测器、圆二色检测器)、分子量检测器、放射性检测器、热学性质检测器、光电导检测器、磁旋光检测器等。

43. 常用的HPLC检测器 ⑴ 紫外-可见分光检测器 ⑵ 示差折光检测器 ⑶ 二极管阵列检测器 ⑷ 蒸发光检测器

44. ⑴ 紫外检测器（UVD） • 优点 UVD结构简单，使用方便，售价便宜、高灵敏度和稳定性。 • 局限性UVD检测的物质必须具有吸收紫外光的生色团，而相应的流动相在检测波长下则应当是无紫外吸收的。这一特性大大限制了其能检测的物质范围和一些良好溶剂的使用。 • 许多成分没有紫外吸收或为紫外末端吸收，有时可用低波长紫外检测器，但梯度洗脱时出现基线漂移，溶剂峰干扰，溶剂选择受其截止波长限制。

45. ㈡ 示差折光检测器(RID) • RID是一种通用的检测器，它基于色谱柱流出物光折射率的变化来连续测定样品浓度。 • 特点稳定、易于操作，样品不被破坏和具有较好的灵敏度。 • 缺点对工作环境要求很苛刻，要求恒温、恒流速，且无法采用梯度洗脱．其检测灵敏度也不够高。

46. ⑶ 光电二极管阵列检测器 (DAD) • 原理光源经光学反射镜通过流动池，再经分光系统、狭缝照射到一组光电二极管上，由数据收集系统实时记录下组分的光谱吸收，得到三维的立体谱图。 • 用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波长紫外光，而不是某一个或几个波长，和普通的紫外—可见分光检测器不同的是进入流动池的光不再是单色光。它具有以下优点： ⑴ 可得任意波长的色谱图，极为方便； ⑵ 可得任意时间的光谱图，相当于与紫外联用； ⑶ 提供组分的定性信息。

47. ⑷ 蒸发光检测器（ELSD） • ESLD是质量型、高灵敏度的通用液相色谱检测器。它检测的三个主要过程： ⑴ 雾化色谱柱流出物经过针头式的细导管进入雾化器，与气体混合喷成均匀一致的雾滴； ⑵ 蒸发雾滴经过加热的漂移管，流动相被蒸发，溶质形成极细的颗粒； ⑶ 检测溶质颗粒气体在检测池发生散射作用，经光电倍增管成电信号输出。

48. ESLD的优点 ⑴ 适用范围广原则上对所有的化合物都能测定，不论化合物是否存在生色团或电活性基团。 ⑵ 适用于梯度洗脱 流动相在样品检测前挥去； ⑶ 高灵敏度与示差检测器(RI)及低波长紫外检测相比。 • 由于它的这些优点，它有可能像气相色谱中的氢火焰检测器(FID)那样成为液相色谱的高灵敏度通用检测器。

49. ESLD的应用 ⑴ 没有紫外吸收或为紫外末端弱吸收的样品 • ELSD的响应与被测物的质量成正比，而不依赖于被测物的光学特性及官能团。理论上可用于挥发性低于流动相的任何组分的检测。在天然药物化学成分中常见的有糖类、皂甙类（皂甙无紫外吸收或仅为末端吸收，使得皂甙测定在应用HPLC-UV法及选择流动相优化分离时均存在一定的困难。ELSD检测则较好地解决了这个问题。从目前国内文献报道来看，ELSD的应用亦以分析这类成分及甾类等最多。 ⑵ 流动相有紫外吸收干扰或梯度洗脱时基线漂移影响测定的情况用ELSD检测，流动相在漂移管便气化蒸发，不影响样品检测。

50. 高效液相色谱的应用 • 中药化学成分分析 • 成分分离制备 (1) 特别适用于极性较大的成分(如皂苷类)分离； (2) 先以分析色谱摸索分离条件； (3) 样品一定要用流动相溶解，再以滤膜过滤。