细胞培养部分计划

1. 细胞培养部分计划 • 0，细胞培养准备工作 • 1，鸡胚原代细胞培养及观察，细胞计数。 • 2，两天后作细胞传代

2. 细胞培养的优点 1.活细胞：能长时间、直接观察、研究 活细胞的形态、结构、生命活动 2.可控制：可控制-选择对象：均一性、重复性 可控制-调节条件：物理、化学、生物等因素可控制-利用方法： 采用各种研究技术、记录方法： 研究：倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原位杂交、同位素标记, 记录：摄影照片、缩时电影 3.应用广： 对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类, 不同组织 4.较经济：提供大量、同时、重复性好的、生物学性状相似的实验对象

3. 细胞培养的缺点 人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同. 当细胞被置于体外培养后, 生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化. 1.与体内主要不同 相对孤立、相对单一缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节 和细胞相互间的影响 2.主要表现失去原有组织结构和细胞形态分化减弱或不显,细胞趋向单一化； 3. 要正确认识体外培养细胞是一种特定条件下生长的细胞群体。

4. 体外细胞培养物的生长类型 按生长方式分成黏附型和悬浮型两种 粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类，如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。 细胞在体内、外的粘附方式存在差异体内：粘附是全方位 ，立体的 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面

5. 体外培养细胞的形态分类 根据形态大致的不同，主要分 上皮样 成纤维细胞样其它，不定型

6. 上皮样细胞型 形态：类似体内的上皮细胞 ，扁平，不规则多角形，中有圆形核。 来源：表皮及其衍生物，乳腺： 外胚层 消化道，呼吸道上皮 内胚层 内皮 中胚层 上皮性肿瘤 与体内上皮区别：体内：单层扁平，单层立方，单层柱状，假复层柱状纤毛，变移，复层扁平。体外：一种，不再区分。

7. 生长特点 易相连成片，铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动

8. 成纤维细胞样细胞 培养中形态与成纤维细胞类似的 形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起， 中有卵圆形核。 来源：成纤维细胞， 平滑肌： 中胚层

9. 生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起

10. 培养细胞的形态不稳定，条件改变，细胞形态可有变化。培养细胞的形态不稳定，条件改变，细胞形态可有变化。 血清Hela 高血清 低血清成纤维细胞样 上皮样细胞pH Hela 太酸或太碱 标准pH成纤维细胞样 上皮样细胞细胞密度3T3 低密度 高密度成纤维细胞样 上皮样细胞 生长状态改变 悬浮或贴附 悬浮 贴附圆形 成纤维或上皮样转化与否 未转化 转化后 成纤维样 可成上皮样

11. 悬浮生长型 概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能 特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团

12. 优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态 缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)

13. 细胞计数 • 用70%酒精清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干； • 取20μl细胞悬浮液小心地从盖玻片的边缘加入血红细胞计数板的两个室，通过毛细管作用，细胞悬浮液在血红细胞计数板和盖玻片之间均匀地分布；切勿加入过量，只要充满即可。 • 置入显微镜，用10倍的目镜和10倍的物镜观察细胞，统计其中四个大的方阵中的细胞数，如果细胞浓度太高，可稀释再统计，记住稀释的倍数； • 细胞浓度=（四个方阵中细胞数之和/4）X 104 /ml，方阵上方和左边边缘的细胞可统计在内，但下方和右边边缘的细胞则不应统计，如有细胞团计为一个。 • 用70%酒精和蒸馏水清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干。

15. 血红细胞计数板(hemocytometer) 含有两个室，每个室被划分为9个方阵，其 中4个方阵有16个小方格，为0.1 mm3或 1 x 10–4 ml，细胞浓度取决于已知体积中的细胞数。

16. 0.4%trypan鉴定细胞死活。 • 而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。

17. 细胞的冻存 - 准备好冻存细胞所需的液氮罐及液氮，细胞冻存管 并写好标签：细胞名称，时间及保存人； • 取对数生长期的细胞(2-5 x 105 cells/ml)，收集细胞前24h换液一次； • 吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入1ml Trypsin-EDTA, 放入37℃保温3-5 min, 使细胞脱离底部； • 离心细胞并重悬浮于10% DMSO/90% FCS 中，大约 1-5 x 106 cells/ml； • 每个冻存管中加入1ml细胞悬浮液，拧紧盖子。 • 冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒(每两个小时温度下降10℃)，放入-20℃冰箱中过夜，第二天再转至-80℃冰箱，可保存数月，如需长期保存，应转至液氮中。

18. 细胞解冻复苏 • 在37℃水浴中预热培养基； • 将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中至解冻，用纸巾擦干管外水分，70%酒精消毒； • 检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 • 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 • 将细胞用移液管放入适量预热的培养基中，混匀，放入 37℃，5% CO2培养箱中培养； • 由于细胞保存液中通常含有DMSO，对细胞生长有毒性，应除去。对于贴壁细胞，待其贴壁后，更换新鲜培养基；对于初始细胞，悬浮培养的细胞以及一些敏感细胞类型应及时通过离心除去DMSO。

19. 无菌操作基本技术  • 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。 • 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可 以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦 拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操 作。

20. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。

21. 清洗步骤 • 用完的器皿泡入水中，用洗涤液（可用洗衣粉）洗涤，瓶口向下晾干，或放入烘烤箱中。 • 细胞培养瓶、吸管、巴氏吸管等玻璃器皿泡入酸液中，大培养瓶用烧杯加入酸液，平放，液面浸没细胞培养面。12hr以上。 • 将酸液全部倒回酸缸，玻璃器皿自来水冲洗15遍，蒸馏水洗三遍，重蒸水二遍。晾干或烤干。 • 注：金属器械、橡胶洗涤干净后用蒸馏水洗三遍，重蒸水二遍。 • 橡胶首次使用时（或较脏）时，分别用酸碱（0.5mol/L的NaOH和HCl）浸泡，煮沸约30min。

22. 酸的配制 • 强酸 • 次强酸 • 弱酸 • 原则1：酸倒入水中2：慢，有耐心（主要散热，搅拌）3：没必要在室外配制，最好附近有水源，万一酸溅到身上要尽快冲洗。

23. 包装 • 内层用干净白纸，外层可用报纸，用线绳扎紧。 • 吸管末端塞棉花，松紧合适，外露些许棉花。 • 需高压灭菌的溶液用一线绳在瓶口导气。

24. 消毒 • 干热消毒等温度上升至160℃,保持1.5~2hr等温度完全下降后方可开启，高温下氧气进入可使纸燃烧。 • 湿热消毒加热放出空气,开始空气较多，后主要为水蒸气。1连续放气至连续的热水蒸气放出。关闭放气阀。2也可（105 ℃ ）5磅放气，物品多时放气两次。高压滤器在有压力后不能放气。 时间一般121℃（15磅）15min~20min培养液体115℃(10磅)10min消毒时必须注意时间与压力（温度）、放入物品间留有一定的间隙。消毒完后等温度下降后开启。 • 过滤消毒滤器在使用前高压消毒滤器安装，将一层薄膜放入两层滤纸间，平放在底座的金属板上，盖上并旋紧螺丝，将出口的玻璃管包紧，进气口可塞入少许棉花，外包一层纱布（或布袋）。放入高压锅中，取出滤器后将螺丝旋紧（高压后有些松）。安装于滤器架中。 • 其他消毒方式一些不能高压，干热灭菌的可以在擦拭干净后放在紫外灯下照射灭菌。气体，射线等。

25. 常用液体的配制

26. dHanks液，上述液体中不加钙镁。 • 配置Hanks液要注意，要按次序加入，前面一种成分全部溶解后才可以加后面一种成分。 • 否则：当时产生沉淀高压后产生沉淀

27. 常用抗生素配制（双抗）

28. 其他液体 • 5.6% NaHCO3 • 5%酚红指示剂 • 0.25%胰酶(可配0.5%) • 用dHanks液配制（不含钙镁） • 胰酶一般需要过滤除菌，在滤膜过滤前先用滤纸过滤掉一些大的颗粒。

29. 抗生素使用种类与浓度：                 工作浓度.  储存温度.  杀灭细菌 penicillin  100 units/ml  -20℃  G(+) bacteria streptomycin  100 ug/ml  -20℃  G(+) and G(-) bacteria chlotetracycline  50 ug/ml  -20℃   G(+) and G(-) bacteria gentamicin  50 ug/ml  -20℃  G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B  2.5 ug/ml  -20℃  yeast and molds nystatin  50 ug/ml  -20℃  yeast and molds fungizone  2.5ug/ml  -20℃  yeast and molds 

30. 血清 1. 血清必须贮存于–20 ～ -70 ℃，若存放于4 ℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一 瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。 2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。

31. 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 ℃ 直接 至37 ℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and 3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法): -20 ℃ 或–70 ℃ 至4 ℃ 冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇 晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20 ℃ 直接 至37 ℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。 4. heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均 匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。除非必须，一般不建 议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有： cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and  • platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell type。

33. 鸡胚成纤维细胞原代培养步骤 • 取9日龄鸡胚，观察，碘酒，酒精棉球表面消毒 • 用镊子打破大头，无菌取鸡胚 • 去除鸡胚脑组织和内脏器官 • 剪碎其余组织 • dHanks液洗涤 • 胰酶洗 • 放入37度水浴锅，消化30min • 倾去胰酶，Hanks液洗涤， • 加培养液，吸管反复冲组织 • 用纱布漏斗过滤 • 细胞计数 • 分装小瓶 • 培养，观察。

34. 细胞传代步骤 • 倾去培养液 • dHanks液洗涤 • 加入胰酶消化，37度，具体时间根据胰酶活性 • 注意控制消化程度，必要时可放在显微镜下观察，以细胞变圆，但尚未脱落为好。消化过度，细胞脱落。消化不够，细胞不能被吹打下来。 • 倾去胰酶， • Hanks液洗涤，此步有时可省略 • 加入新培养液， • 轻轻吹打，最好不要产生气泡。 • 分瓶培养

35. 悬浮型细胞传代  • 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。 • 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。 

36. 需要大家自己清洗，包装的东西 • 手术器械，手术剪，眼科剪，镊子，弯头镊 • 培养瓶，培养瓶塞 • 三角烧瓶，小烧杯，培养皿，加纱布漏斗 • 吸管，移液管 • 酒精棉球