Introduction aux radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène

1. Introduction aux radicaux libres et espèces réactives de l’oxygène Pr H Puy

2. OXYGENEespèces réactives de l'oxygène (ROS) Il existe des micro-organismes pour lesquels l’oxygène est inutile, et même toxique: anaérobies. L’oxygène est indispensable à la vie des êtres pluricellulaires (aérobies) L’oxygène est nécessaire à au Tfert d’e- couplé aux phosphorylations oxydatives : source principale de leur énergie

3. L ’ANOXIE EST MORTELLE A COURT TERME Entraîne une chute de l’ATP cellulaire Les tissus résistent inégalement à l’anoxie : Le cerveau est détruit en 3 minutes Foie, rein et myocarde en qq heures Muscle, peau et phanères, bcp plus tard.

5. CARACTERE TOXIQUE DE L ’OXYGENE Cependant, l’oxygène est toxiquepour les organismes Son utilisation requiert des mécanismes protecteurs Le caractère toxique de l’oxygène participe à la pathogénie de nombreuses maladies

6. ROS: PRODUITS ACCIDENTELS Toutes les réactions impliquant O2 et des ions métalliques peuvent induire des «bavures» En particulier les flavoprotéines, et surtout les oxydases

7. Principales ROS ROS (Reactive Oxygen Species) Ion superoxyde (O2-.) Radical hydroxyle (OH.) Ion hydroxyle (OH-), Peroxyde d ’hydrogène (H2O2) Origines : chaînes respiratoires mais pas uniquement

8. Un radical libre(RL)est constitué par tout atome, groupe d’atomes ou molécules où au moins un électron non apparié occupe une orbitale externe [] Le radical s’en trouve doté d’une réactivité particulière et peut ainsi réagir avec d’autres atomes ou molécules et se comporter, selon le cas, comme un oxydant ou comme un réducteur, afin d’apparier son électron célibataire Notion de radical libre et définitions I

9. Notion de radical libre et définitions II • L'oxygène moléculaire diatomique (O2) joue un rôle essentiel dans le métabolisme aérobie comme accepteur terminal d’électrons • O2peut former des espèces partiellement réduites, les espèces oxygénées réactives [EOR]radicalaires ou non: anion superoxyde (O2º-), peroxyde d'hydrogène (H2O2) et radical hydroxyle (HOº) • Les espèces oxygénées réactives sont des produits normaux du métabolisme. Leur production basale correspondrait à 3 % de la quantité totale d'oxygène consommé

10. Le stress oxydant est observé lorsque la production des espèces oxygénées réactives dépasse les capacités de défense des tissus Il entraîne des altérations des composants cellulaires, dues aux réactions chimiques des espèces oxygénées réactives avec les lipides, les protéines et les acides nucléiques cellulaires Notion de radical libre et définitions III

11. Radicaux libres (RL) • un "radical libre" (RL) est une espèce chimique • - qui possède un électron non apparié ('célibataire') • - qui a une existence indépendante ('libre') • nb: • 1/ un RL est généralement écrit R. • 2/ certains radicaux sont électriquement neutres • tandis que d'autres sont chargés : il existe des radicaux cationiques R.+ et des radicaux anioniquesR.-

12. Espèce réactives de l'oxygène (ROS) et Radicaux libres oxygénés (RLO) • Formes réactives de l'oxygène (ROS) • _______________________________________________________ • Formes radicalaires (RLO)Formes non radicalaires • _______________________________________________________ • superoxyde O°-peroxyde d'hydrogène H2O2 • hydroxyle OH°acid hypochloreux HOCl • peroxyle ROO°ozone O3 • alkoxyle RO°oxygène singulet1Dg • hydroperoxyle HOO°peroxynitrite ONOO- • _______________________________________________________

13. LES FORMES REACTIVES DE L’OXYGENE (FRO/ROS) Les radicaux libres (RLO): atomes ou molécules ayant un électron non apparié ou célibataire Les dérivés non radicalaires NADPH Oxydase et autres systèmes SOD ou Spontanée en+H+ MPO HOCl H2O2 O2 O.-2 NADP - +H + Fe2+ / Cu2+ NADPH OH. 1O2 O.-2 anion superoxyde; H2O2 péroxyde d’hydrogène ou eau oxygénée; OH.radical hydroxyl; HOCl acide hypochloreux; 1O2 oxygène singulet, SOD superoxyde dismutase, MPO myélopéroxydase

14. 1 O 2 . - OH O2 . - NO ONOO Métabolites réactifs de l’oxygène  Métaux h Monooxygénases Quinones Oxydases UVA . SOD O H2O2 2 Fenton NOS Arg Toute fuite d’électrons en présence d’O2 conduit à la formation d’ERO (Espèces Réactives de l ’Oxygène)

15. Demi Vie de Différentes EOR Espèces réactives Demi-vie (s) Conc.Physiol (mol/l) Hydroxyl radical (OH) Alcoxyl radical (RO) Singlet oxygen (1O2) Peroxynitrite anion (ONOO-) Peroxyl radical (ROO) Nitricoxide (NO) Hydrogenperoxide (H2O2) Superoxide anion (O2-) Hypochlorousacid (HOCl) 10-9 10-6 10-5 0.05 – 1.0 7 1 - 10 spontan. heures/jour (accelere par enzymes) spontan. heures/jour (SOD accel. 10-6) 10-9 10-9 - 10-7 10-12 - 10-11

17. L’oxygène singulet : Il existe sous deux formes : l’oxygène noté 1Σ g+ où les deux électrons célibataires sont de spin opposé. Cette forme très instable se transforme en : 1Δg non radicalaire Formes activées de l’oxygène

18. L’anion super oxyde (O2º-) : Par capture d’un électron, l’oxygène triplet est réduit en anion superoxyde O2 + 1e-O2 º- Il est produit majoritairement par la chaîne mitochondriale, mais également par les oxydases Formes activées de l’oxygène

19. Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) : Par réduction divalente de l’oxygène: O2 + 2e- + 2H+H2O2 (oxydases) Par dismutation de O2.-: 2 O2º- + 2H+H2O2 + O2

20. Le radical hydroxyle (OH.) : La coexistence de l’anion superoxyde et du peroxyde d’hydrogène peut engendrer cette espèce oxygénée très réactive Cette réaction est catalysée par des métaux de transition (comme Fe2+ et Cu+): Réaction de Fenton H2O2 + Fe2+ Fe3+ + OH- + OHº

22. Fe2+ est reconstitué par divers réducteurs dont l’anion superoxyde. Fe3+ + O2- Fe2+ + O2 L’ensemble de ces réactions donne le bilan de Haber Weiss ou cycle de Haber Weiss. H2O2 + O2º- O2 + OH- + OHº

23. L’acide hypochloreux (HOCl) : Par l’action desmyéloperoxydases, H2O2 donne naissance à HOCl au cours de la réaction suivante H+ + Cl- + H2O2 HOCl +H2O Pathologies inflammatoires: granulomatoses Absence de Myeloperoxidase Augmentation de la susceptibilite aux infections

24. Le monoxyde d’azote (NO) : L-arginine + 2 NADPH + O2 L-citrulline + NOº + 2NADP+ La production concomitante de NOº et de superoxyde à un même site entraîne la formation du peroxynitrite (OONO-) qui est hautement cytotoxique NOº + O2º- ONOO-

25. Synthèse des Voies de formation des EOR Cyclo-oxygénases Lipo-oxygénases Echappement chaîne respiratoire

26. Les multiples origines des ERO • Physiologiques: respiration, hormones, cytokines, phagocytose • Physiopathologiques: déficit en GSH, déficit enzymatique, • maladie mitochondriale, inflammation • Physique ou chimique: irradiation, xénobiotiques oxydants • (médicaments, polluants) • Autres stress: stress du réticulum, stress thermique, hypoxie, • stress mécanique….

27. CERTAINES OXYDORÉDUCTASES UTILISENT L’O2 SANS PRODUCTION D’ÉNERGIE Les oxygénases fixent une molécule d’O2 sur les substrats Les oxydases oxydent les atomes d’hydrogène des substrats en H2O2 Les hydroxylases fixent un OH sur une chaîne carbonée Réactions de synthèse : hormones, neurotransmetteurs,…. Réactions de dégradation : acides aminés aromatiques, cholestérol, hème, purines,….

28. Autres systèmes de production Auto-oxydation Cyclo-oxygénase et lipo-oxygénase Système de transport des électrons dans la membrane nucléaire Xanthine/xanthine oxydase O NH HN O NH O NH Guanine Hypoxanthine NAD+ O2 H2O2 O2. NADH H2O NH3 Guanase Xanthine oxydase Xanthine NAD+ O2 NADH H2O2 O2. Acide urique

29. Origine des EOR Sources endogènesexogènes peroxysome radiation, ultrasons mitochondrie cigarette autooxydation drogues EOR phagocytes chaleur oxyhemoglobine pesticides enzymes oxydantes infections detoxification hyperoxie, exercice pollution (NOx, O3)

32. Les mitochondries sont la principale source de production de radicaux libres Exception pour le foie, où les microsomes sont les principaux producteurs

33. Chaîne respiratoire et production radicalaire au niveau mitochondrial Tetraréduction 95% Ion superoxyde 3-5% Peroxyde d ’hydrogène Monoréduction OH Radicale hydroxyle

34. Métabolisme des peroxydes, des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote Synthèse des plasmalogènes b-oxydation des acides gras a-oxydation des acides gras Métabolisme du glyoxylate Métabolisme des acides aminés (dégradation des isomères D des acides aminés, catabolisme de la L-lysine, dégradation des polyamines) ROLES DES PEROXYSOMES

35. Oxydases peroxysomales Glycolate oxydase, D-amino acide oxydase, urate oxydase… Les peroxysomes utilisent une part importante de l’O2 Production majoritaire de l’ H2O2

36. Cytochrome P450 du réticulum endoplasmique Réaction de mono-oxygenation: A-H + O2 + NADPH,H+A-OH + H2O + NADP+ Le réticulum endoplasmique est riche en cytochromes P450 impliqués dans les processus de détoxification.

37. P450FeIII P450–FeIII-SH Mécanisme génèse EROS NADPHCytP450 reductase 2e- O2 P450-FeIII-SH SOH O22- P450-FeIII-SH + O2-et/ou H2O2 P450-FeIII

38. ROS ET DÉFENSE CONTRE LES MICRO-ORGANISMES Les globules blancs utilisent l’O2 pour tuer les bactéries qu’ils ont phagocytés Les monocytes et polynucléaires neutrophiles ont un mécanisme spécial pour créer des radicaux libres oxygénés

39. ROS et défenses anti-infectieuses

41. Complexe actif O2 O2.- gp91 gp91 p22 p22 Rap1A Rac Rap1A Rap1A P GTP NADPH + H+ p47 P activation P Rac p67 NADP GTP P P p47 P p67 p40 P P p40 P P P Comment se forment les RL, les RLO et les ROS ? (7) • Exemples de systèmes enzymatiques générateurs de ROS • NADPH oxydase Assemblage et activation de la NADPH oxydase des phagocytes d'après MH Paclet et F. Morel

42. H2O2 + Cl-HOCl + OHº Activation des polynucleaires NADPH + 2O2 2O2º-+ NADP+ + H + La NADPH oxydase (FAD, cytochrome b) H2O2 La myeloperoxydase production O2º- , OH º

43. MEFAITS DES ROS Stimulées par les radiations ionisantes Mutations del’ADN Peroxydation deslipides Altération des protéines Perturbent la transduction dessignaux Modulent les gènes et les protéines de stress régulant la prolifération la différenciation cellulaire et l’apoptose

44. Les effets des ERO • Effets physiologiques: croissance cellulaire, inflammation • Effets toxiques: ADN, ARN, lipides, protéines • Adaptation au stress oxydant: • induction des gènes « anti-oxydants » • répression des gènes « pro-oxydants »

45. Toxicité des ERO • ADN: génotoxicité; 8-OH-Guanine, Mutagenèse, cancer • ARN: oxydation et altération • Lipides: peroxydation, toxicité des produits oxydés, • signalisation, athérosclérose ? • Protéines: oxydation des acides aminés (Cys, Met…) • Nitrosylation (NO), Carbonylation • dénaturation (protéines chaperon), • agrégation, maladies dégénératives ? • Glucides: glycation et dérivés • Diabète

46. Les cibles Moléculaires des • espèces réactives de l'oxygène (ROS) • - Quelque exemples de dérivés d’oxydation des bases duDNApar les ROS. Les altérations du DNA peuvent induire des mutations ou la mort de la cellule

47. Les cibles Moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS). • Exemples d’effets • des ROS • sur leslipides: • exemple de la • formation de l’isoprostane

48. Les cibles Moléculaires des Radicaux libres (RL) et radicaux oxygénés (RLO), • espèces réactives de l'oxygène (ROS), • - Oxydation des lipides par les ROS Aldéhydes dérivés d’acides gras polyinsaturés Dérivés du cholestérol: oxystérols

49. Les cibles moléculaires des espèces réactives de l'oxygène (ROS) • - Exemples d’effets • des ROS sur les protéines: • dérivés d’acides aminés Les modifications des protéines peuvent induire des altérations fonctionnelles

50. Stress oxydant: adaptation et défense • 1ère ligne: • molécules anti-oxydantes; GSH, Vit C, Vit E, biliverdine …. • 2ème ligne: • induction ou répression des gènes • Activités enzymatiques anti-oxydantes: GPx, Cat, SOD, Hox… • Activités enzymatiques pro-oxydantes: CYP, oxydases… • Réparation: ADN, protéines (Trx, Trx réductase, chaperon) • Dernière ligne: • apoptose