MİKROBİYAL BÜYÜME KİNETİĞİ

1. MİKROBİYAL BÜYÜME KİNETİĞİ SEMA ÇOBAN 620071001

2. MİKROORGANİZMALARIN GELİŞME ŞARTLARI • Mikroorganizmaların Besin İhtiyaçları Organizmaların enerji sağlayabilmesi, hücre bileşenlerini yapabilmesi, gelişmesi, çoğalması ve yaşayabilmesi için beslenmesi ve bu nedenle de çeşitli gıda maddelerini alması gereklidir. Bu maddelerin bir bölümü doğrudan ortamlardan sağlanmasına karşın bir kısmı da hücre içinde sentezlenir. Böylece yaşam için gerekli olan mikro ve makro moleküller hazırlanır ve gerekli yerlerde kullanılır.

3. Mikroorganizmaların yapıları incelendiğinde, kuru ağırlıklarının %95'inden fazla bir kısmını bazı temel elementlerin (karbon, oksijen, hidrojen, azot, sülfür, fosfor; potasyum, kalsiyum, magnezyum ve demir) oluşturduğu görülür. Bunlara, aynı zamanda, fazla ihtiyaç duyulur ve bulundukları ortamdan fazla miktarlarda alınırlar. Bu maddelere, makro element (makro nütrient) adı da verilmektedir.

4. Tabiatta, çok çeşitli beslenme özelliği olan mikroorganizmalar bulunmaktadır. Bazıları, içinde çok az miktarlarda besin maddeleri bulunan minimal ortamlarda gelişebilmekte ve yaşayabilmektedir (prototrof). Buna karşın bir kısmı da özellikle, mutantsuşlar, daha komplike ve zenginleştirilmiş besi yerlerinde yaşayabilmektedirler

5. Mikroorganizmaların ihtiyaç duyduğu gıda maddelerini 2 gruba ayırabiliriz; • 1- İnorganik maddeler    • 2- Organik maddeler

6. 1. İnorganik Maddeler • Oksijen (O2) • Karbondioksit (CO2): • Karbon (C): • Azot (N): • Su (H2O): • Diğer elementler:

7. Oksijen (O2) Mikroorganizmalar oksijene olan ihtiyaç durumlarına göre; • Aeroblar: %21 0ksijen'de gelişirler • Mikroaerofilikler:   %17 O2 de  gelişenler • Fakültatifler: Hem aerobik hem de anaerobik koşullar altında gelişenler. • Anaeroblar:  Son elektron alıcı  olarak O2’ yi kullanacak solunum sistemi olmayanlar olmak üzere 4 bölüme ayrılırlar.

8. Karbondioksit (CO2): • Mikroorganizmaların çoğu, havada bulunan kadar (%16; %0.4), karbondioksite gereksinme duyarlar ve fazlası genellikle gelişme ve üreme üzerine olumsuz etkide bulunur.

9. Karbon (C): • Karbon, bakterilerde bulunan mikro-ve makro-moleküllerin yapısına girdiğinden ihtiyaç duyulan önemli bir maddedir. Ototrof mikroorganizmalar karbon kaynağı için inorganik bileşiklerden, heterotroflar da organik bileşiklerden yararlanırlar.

10. Azot (N): • Azot, bakterilerdeki çeşitli moleküllerin yapısına girmesi yanı sıra, aynı zamanda enzimler, üreme faktörleri, nükleik asitlerdeki pürin ve pirimidin bazlarında da bulunurlar. Bu nedenle çok önemli bir elementtir ve bakteriler bunu çeşitli kaynaklardan temin ederler (amonyum tuzları, organik asitler, amino asitler, vs.). 

11. Su (H2O): • Bakteri metabolizması ve hücrelerin gelişmesi su ile çok yakından ilişkilidir. Su olmayan veya yeterince bulunmayan ortamlarda, gıda alışverişi, bakteri içinde sentezlenen enzimlerin ve oluşan metabolitlerin dışarı çıkması güçleşir ve hatta durabilir. Bu durum da bakterinin ölümüne neden teşkil edebilir. Katı ortamlarda bulunan gıdanın koloni içinde bulunan mikroorganizmalara ulaşması difüzyonla olur. Bu gıda girişi de su ile mümkün olduğundan, suyun beslenmedeki önemi belirgin olarak ortaya çıkar. Bu nedenle, suyu fazla ve yarı katı olan ortamlar, suyu az olanlardan daha çok geliştirme özelliğine sahiptirler. Sıvı besi yerleri de bu bakımdan katı besi yerlerinden daha iyidir.

12. 2. Organik Maddeler • Vitaminler: • Pantotenik asit: • Nikotin amid: • Üreme faktörleri:

13. Vİtamİnler: • Vitaminler, koenzimlerin yapısına giren ve bunların öncülü olan maddelerdir. Bakteriler genellikle vitaminleri sentez edemezler ve bunları ihtiyaçlarına göre ortamdan alırlar. Ancak, mayaların B-vitaminlerini sentez kabiliyetleri vardır. Bu nedenle mayalar, üremeyi teşvik etmek için, besi yerlerine katılırlar.

14. Pantotenİkasİt: • Pantotenik asit, pantotenat olarak koenzim-A'nın bir parçasıdır. Koenzim-A, özellikle, karbonhidrat, amino asit ve lipid metabolizması ile yakından ilişkilidir. Bazı bakteriler, pantotenikasite, bir kısmı da pantoik asit ve beta-alanin'e ihtiyaç gösterirler.

15. Nİkotİnamİd: • Pirimidin nükleotidlerin (DNA, NADP) bir parçası olan nikotin amid, oksidasyon ve redüksiyon olaylarında görev yapar. Folik asit'in bir parçası olan paraaminobenzoik asit (PABA), tertrahidrofolikasitin (koenzim) bir öncülüdür.

16. Üreme faktörlerİ: • İnositol, mantar, maya ve actinomyces'ler; kolin, pnömokok ve mikoplasmalar; sterol, glutamin, asparagin, spermidin, putresin ve permin bazı bakteriler tarafından ihtiyaç duyulur..

17. MİKROBİYAL GELİŞME ÜZERİNE ÇEVRENİN ETKİSİ: • Mikroorganizmalar çevredeki kimyasal ve fiziksel durumlardan etkilenirler. Çevre şartları mikroorganizmaların metabolik reaksiyonlarını ve büyümelerini etkiler. Sıcaklık, pH, su mevcudiyeti ve oksijen mikroorganizmaların gelişmesini etkileyen çevre faktörüdür.

18. SICAKLIĞIN ETKİSİ Mikroorganizmalar sıcaklığa göre , • 1) Psikrofilik : 0 – 20 °C de gelişenler • 2) Mezofilik : 25 - 45°C de gelişenler • 3) Termofilik : 45 - 80°C de gelişenler • 4) Hipertermofilik : 80°C ‘nin üstünde olmak üzere dört gruba ayrılır.

19. (pH) ETKİSİ: • Düşük pH'da yaşayanlar asidofilikler olarak adlandırılır. • Nötrofilik organizmalar ise pH 6-8 de yaşarlar. • pH 10-11 arasında gelişenler ise alkalofiliklerdir.

20. Mİkrobİyal kültür ve oksİjenİnetkİsİ: • Çoğu aerobların gelişmesi için yoğun havalandırma şarttır. Çünkü oksijen suda çok az çözülür ve organizma tarafından kullanılan oksijen yeniden ortama difüzyonla hızlıca geçemez. Bu sebepten havalandırma şarttır. Anaerobik kültür için ortamdan oksijen çıkartılmalıdır.

21. MİKROBİYAL GELİŞME ÜZERİNE OZMOTİK ETKİLER: • Bazı mikroorganizmalar tuzsuz ortamda gelişemezler.Bu tür mikroorganizmalar halofilikler olarak adlandırılır. • Tuza toleranslı olan mikroorganizmalar ise hem tuzlu ortamda hem de tuzsuz ortamda gelişebilen mikroorganizmalardır. • Yüksek şeker içeren ortamlarda gelişenler ise “osmofiller” , kuru ortamlarda gelişenler ise kserofiller olarak adlandırılır.

22. MİKROORGANİZMA BÜYÜME KİNETİĞİ • Endüstriyel boyutta bir üretimin planlanması aşamasında üretilecek veya katalizör olarak kullanılacak mikroorganizmanın en uygun tür olduğunun belirlenmesi, mikroorganizmanın fizyolojik özelliklerinin tespiti, ortam faktörlerine bağlı değişimi ve teknolojik açıdan en uygun reaktörün şekillendirilmesi gerekir.

23. Fermantasyon sistemleri ; • Kesikli, • Kesikli beslemeli ve • Sürekli olmak üzere üç gruba ayrılır.

24. 1.Kesikli Sistemde Mikroorganizma Büyüme Kinetiği • Mikroorganizmaların büyümesi belirli kurallara uyar. Bu nedenle, bazı koşullar altında inkübasyon sonunda beklenen hücre sayısı ve biyokütle miktarı önceden belirlenebilir. Mikroorganizma büyümesi değişik evrelerde gerçekleşmektedir.

25. A. Hazırlık evresi: Hücre bölünmesinin görülmediği bu evre ilk hücre bölünmesi gerçekleşinceye kadar devam eder. Aşılanan hücre sayısında hiçbir değişiklik olmaz. Besi ortamından alınan su ve substratlar RNA, ribozom ve protein biyosentezinde (özellikle enzim sentezinde) kullanılır. Bu nedenle, hücre çoğalması olmadığı halde biyokütle artar.

26. B. Hızlanma evresi: Bu evrede hücre çoğalması başlar ama yavaş yürür,artış üssel (logaritmik) değildir. DNA miktarı artar, enzim sentezi devam eder ve hücrelerdeki RNA miktarında önemli artış olur. Bazı bakımlardan benzerlik gösterdiklerinden çoğu kez A ve B evreleri birlikte değerlendirilir ve lag fazı adını alır.

27. C. Logaritmik evre: Büyüme hızı pratik olarak sabittir ve maksimuma ulaşmıştır. RNA’ya oranla DNA sentezi daha fazladır. Hücreler diğer evrelere göre daha küçük olup hücrelerin kuru kütlesinin, hücre sayısına oranı diğer evrelerden daha düşüktür. Bu evredeki hücre çoğalması kolayca hesaplanabilir. • D. Yavaşlama evresi: Bu evrede hücre çoğalma hızı sürekli azalır. Fakat hücre sayısı ve biyokütle artışı devam eder.

28. E. Durgunluk evresi: Bu evrede yeni oluşan hücre sayısı ile ölen hücre sayısı dengelenmiştir. Toplam hücre sayısı sabit kalır. • F.Ölüm evresi: Ölen hücrelerin sayısı yeni oluşanlardan daha fazladır. Otoliz sebebiyle ortamın yoğunluğu ve viskozitesi azalır.

29. Şekil 1.Mikroorganizmaların büyüme eğrisi

30. Kemostat: • Hücreler uzun süre sabit çevrede tutulmak istendiğinde devamlı kültür tekniği kullanılır. Burada sabit bir hacimde taze besiyeri ortama sürekli olarak ilave edilir. Yine aynı hacimde besiyeri ortamdan devamlı uzaklaştırılır. Böyle bir sistem dengededir. Bu sistemde hücre sayısı ve besin durumu sabittir. Sistem ise sabit sistem( steadysystem) denir. Devamlı kültür aletine kemostat denir. Bu alet hem kültürün populasyon yoğunluğu hem de kültürdeki büyüme oranını kontrol eder. Dilüsyon oranı, karbon ve azot kaynağı gibi sınırlı besin konsantrasyonu kemostat kontrolünde kullanılır.

31. μ ; Spesifik büyüme hızı, hücre kütlesinin toplam biyokütleye göre birim zamandaki artışıdır. Hücrelerin spesifik büyüme hızı, büyüme eğrisinin birinci türevinden bulunur. Şekil 2.Kesikli kültürde hücrelerin çeşitli fazlardaki spesifik büyüme hızları

32. Şekil 3. Mikroorganizmaların logaritmik fazda çoğalmaları

34. Mikroorganizma büyüme hızı asağıdaki formül ile ifade edilir:

35. biyokütlenin zamana baglı değişimi;

36. Spesifik büyüme hızı µ, şu üç parametrenin bir fonksiyonu olarak bulunabilir: S: sınırlayıcı substrat konsantrasyonu, µmax: Maksimum büyüme hızı, Ks: Substrat spesifik sabiti. • Buna göre aşağıdaki eşitlik çıkarılabilir;

37. Monod eşitliğinde, ortamda bol miktarda substrat varsa µ=µ m olacaktır. Ve kültür logaritmik evrede maksimum büyüme oranına sahip olacaktır. • Ks değeri genellikle çok düşüktür. Örneğin E. coli’de glikoz için 1,0mg/l, triptofan için1,1 mg/l olarak ölçülmüştür.

38. µ morganizmaya ve fermantasyon koşullarına bağlı bir sabittir. Aşağıdaki tabloda bazı funguslara ait µ m değerleri verilmiştir. Tablo 1. Bazı fungusların glikozda maksimum büyüme hızı değerleri

39. Monod denkleminin geçerli olmadığı durumlar da vardır. Örneğin mikroorganizma kompleks besin ortamlarında çoğaltılırsa genellikle birden fazla log fazı görülebilir. Bu fazların ayrımı mikroorganizmanın katabolikrepresyonuna dayanır. Mikroorganizma kolay kullanabileceği (genellikle glikoz) şekeri parçalamak için enzimlerini sentezlerken diğer kaynağı kullanacak enzimlerin üretimini baskılar.

40. Tablo 2. Kinetik Modeller

41. 2.Kesikli Beslemeli (Fed-Batch) Sistemde Mikroorganizma Büyüme Kinetiği: • Kesikli beslemeli fermantörler kesikli ve sürekli sistemlerin avantajlarını beraberce taşıdığı için endüstride yaygın olarak kullanılırlar. (Penisilin üretiminde) Katabolikrepresyona açık olan substratların sisteme kontrollü verilmesine olanak tanıyan bir yöntemdir.

42. KESİKLİ BESLEMELİ SİSTEM • Proses başlangıçta kesikli olarak başlar. Besin elementleri tükenmeye başlayınca substrat, fermantasyon sırasında çeşitli zamanlarda azar azar ortama ilave edilir. İlave besin eklenmesi hem logaritmik hem de durgun faz sırasında yapılır. Bu hem biyomas hem de sekondermetabolit miktarının artmasına neden olur. Özellikle rekombinantmikrorganizmalardan protein üretiminde kesikli beslemeli fermantasyon tipi benimsenmektedir.

43. KESİKLİ BESLEMELİ SİSTEM • Ancak kritik öneme sahip besin elementinin konsantrasyonu çok iyi takip edilmelidir. Başlangıçta fermantöre konan substratın mümkün olduğu kadar konsantre olması istenir. Böylece reaktör hacminin neden oluğu problemler de aşılmış olur. Kesikli beslemeli fermantasyonun en önemli avantajı hem reaksiyon oranının hem de metabolik reaksiyon hızının substratın ilave oranına göre kontrol edilebilmesidir. Oksijen transferi ve soğutma gibi fermantasyona etki eden parametreler reaksiyon oranı kontrol edilerek kontrol altında tutulabilir.

44. SÜREKLİ SİSTEMDE MİKROORGANİZMA BÜYÜME KİNETİĞİ

45. Fermantördeki sıvı hacminin değişmediği koşullarda denge koşullarına ulaşılır ve böyle bir sistem matematiksel olarak; Burada; • V: sistemde bulunan sıvı hacmi (l), • F: substrat çözeltisinin sisteme akış hızı (L/saat) • D: ise seyreltme hızı (bir saatte reaktör içinden dışarı alınan sıvı miktarı)’dır

47. Denge koşullarında dS/dt = O ve μ = D olduğundan,

49. KRİTİK SEYRELTME HIZI

50. Endüstriyel fermantasyonlarda temel konu maliyetlerin minimuma, ürün veriminin maksimuma çıkarılmasıdır. • Sürekli kültürlerde elde edilen hücre biyomasının üretim maliyeti, kesikli fermantasyona göre daha düşüktür.