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第十二章 细胞凋亡与检测技术

第十二章 细胞凋亡与检测技术. 第一节 细胞凋亡的生物学意义及其相关基因. 一、细胞凋亡的概念与生物学意义. 对于一个多细胞生物来说，要维持 完整性和保持平衡性 ，凋亡是一个非常重要的生物学过程。 多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。. 细胞的衰老. Hayflick 界限 (Hayflick Limitation ）. 概念： 关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick 界限 。.

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第十二章 细胞凋亡与检测技术

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Presentation Transcript

  1. 第十二章 细胞凋亡与检测技术

  2. 第一节 细胞凋亡的生物学意义及其相关基因 一、细胞凋亡的概念与生物学意义 对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常重要的生物学过程。 多细胞生物的诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴随着细胞凋亡过程。

  3. 细胞的衰老 Hayflick界限(Hayflick Limitation） • 概念： 关于细胞增殖能力和寿命是有限的观点。细胞，至少是培养的二倍体细胞，不是不死的，而是有一定的寿命；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，这就是 Hayflick界限。 • 癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞 • 细胞的增殖能力与供体年龄有关 • 物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系

  4. 二倍体细胞的衰老是由细胞本身决定的 ◆决定细胞衰老的因素在细胞内部，而不是外部的环境 ◆是细胞核而不是细胞质决定了细胞衰老 不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数

  5. 细胞在体内条件下的衰老 • 在机体内，细胞的衰老和死亡是常见的现象，甚至在个体发育的早期也会发生; • 正常情况下终生保持分裂的细胞，其分裂能力是否随着有机体年龄的增高而下降？它们 会不会衰老？ • 衰老动物体内，细胞分裂速度显著减慢，其原因主要是G1期明显延长; • 衰老个体内的环境因素影响了细胞的增殖和衰老; • 骨髓干细胞移植实验说明随着年龄的增加，干细胞增殖速度也趋缓慢.

  6. 衰老细胞结构的变化 • 细胞核的变化： • 体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大； • 细胞核的核膜内折（invagination）、染色质固缩化； • 内质网的变化： • 衰老动物内质网成分弥散性地分散于核 周胞质中，粗面内质网的总量似乎是减少了； • 线粒体的变化： • 通常细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大； • 致密体的生成：脂褐质，老年色素等 • 膜系统的变化： • 衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。 • 衰老细胞间间隙连接减少；细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化（减少）。

  7. 细胞衰老的分子机理 • 氧化性损伤学说：代谢过程中产生的活性氧基团或分子（ROS---O2-， OH-， H2O2），引发的氧化性损伤的积累，最终导致衰老。 • 端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的 “有丝分裂钟”学说（Harley,1990） • rDNA与衰老: 酵母染色体外rDNA 环的积累，导致细胞衰老。 • 沉默信息调节蛋白复合物与衰老：复合物存在于异染色质区，其作用在于阻断所在位点DNA转录。.

  8. 细胞衰老的分子机理 • SGS1基因和WRN基因与衰老： SGS1基因和WRN基因同源,编码解旋酶; 酵母sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突变引发早老症. • 发育程序与衰老: • 线粒体DNA与衰老: Sen-DNA(80年代);mtDNA突变积累与细胞衰老有关

  9. (一)细胞死亡的方式 死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非与机体死亡同步。 正常的组织中，经常发生“正常”的细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。 细胞死亡的方式通常有3种： ①细胞坏死（necrosis） ②细胞凋亡（apoptosis） ③细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）

  10. (二)、细胞坏死（necrosis） • 影响因素 • 化学因素（如强酸、强碱、有毒物质） • 物理因素（如热、辐射） • 生物因素（如病原体）

  11. 坏死细胞的形态改变 • 2种病理过程 • 酶性消化 • 蛋白变性 • 参与此过程的酶，如来源于死亡细胞本身的溶酶体，则称为细胞自溶（autolysis）；若来源于浸润坏死组织内白细胞溶酶体，则为异溶（heterolysis）

  12. 坏死细胞的形态改变 • 初期 胞质内线粒体和内质网肿胀、崩解，结构脂滴游离、空泡化，蛋白质颗粒增多，核发生固缩或断裂 • 中期 随着胞质内蛋白变性、凝固或碎裂，以及嗜碱性核蛋白的降解，细胞质呈现强嗜酸性，导致细胞结构完全消失， • 末期 细胞膜和细胞器破裂，DNA降解，细胞内容物流出，引起周围组织炎症反应

  13. 细胞死亡 组织病理学的中心议题 • 遭受缺氧，病毒感染和某些毒素的损害而导致的关键性终结点 • 细胞死亡现象也是生命新陈代谢的固有本质 • 例如胚胎发育、正常组织更新，以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当的克隆，这种细胞生理性死亡是种系发育史中早就存在的，有利于动物发育中的许多生命功能。

  14. 采用什么样的标准可以比较在不同情况下，不同类型的细胞死亡呢？采用什么样的标准可以比较在不同情况下，不同类型的细胞死亡呢？ 形态学 1972年Keer根据细胞发生了与坏死完全不一样的死亡过程而提出了细胞凋亡（Apoptosis）的概念。

  15. Kerr实验 • 结扎大鼠肝的左、中叶门静脉后 • 周围细胞发生缺血性坏死 • 由肝动脉供应区的实质细胞仍存活，只是范 围逐渐缩小，其间一些细胞不断转变成细胞 质小块，不伴有炎症 • 在正常鼠肝中也偶然见到这一现象

  16. （三）凋亡 Apo 从… ptosis 飘零，落下 Apoptosis凋亡 细胞象秋天的树叶一样凋落的死亡方式

  17. 指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。它是一个主动的、高度有序的，基因控制的，一系列酶参与的过程。 凋亡的概念 During development of a multicellular eukaryotic organism, some cells must die. Unwanted cells are eliminated during embryogenesis, metamorphosis, and tissue turnover. This process is called or apoptosis.

  18. 凋亡是生物体普遍存在的现象 • 胚胎形成 • 衰老和损伤细胞的清除 • 自身反应性T淋巴细胞的清除 • 肿瘤的发生、发展和转归 • 干细胞 并非每个细胞都能走到终点，相当一部分细胞，甚至绝大部分细胞都会在中途凋亡 • 胸腺的T细胞95%存活不到成熟T细胞阶段 • 原始和幼稚红细胞在骨髓中发生“原位溶血”

  19. 凋亡细胞的主要特征 ①染色质聚集、分块、位于核膜上，胞质凝缩，最后核断裂，细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体 ②凋亡小体内有结构完整的细胞器，还有凝缩的染色体，可被邻近细胞吞噬消化，因始终有膜封闭，没有内溶物释放，故不会引起炎症

  20. 细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构 凋亡细胞早期

  21. 凋亡细胞中期 细胞核的染色质高度凝聚、边缘化

  22. 细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 凋亡细胞晚期

  23. 凋亡小体—1

  24. 凋亡小体—2

  25. 凋亡小体—3

  26. 细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期： 早期的细胞核呈波纹状或呈折缝样部分染色质出现浓缩状态；中期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；晚期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体

  27. ③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止③凋亡细胞中仍需要合成一些蛋白质，但是在坏死细胞中ATP和蛋白质合成受阻或终止 ④核酸内切酶活化，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成约200bp整数倍的核酸片段，凝胶电泳图谱呈梯状 ⑤凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化

  28. 细胞凋亡的生化特征－DNA阶梯

  29. 凋亡的意义 • 由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。 • 生物适应环境的需要 蝌蚪尾巴的脱落 脊椎动物的神经系统的发育 哺乳动物指（趾）的形成 • 使各种细胞的生存时限达到平衡

  30. 小结 细胞凋亡与细胞坏死的区别

  31. Apoptosis vs necrosis

  32. 细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） 细胞程序性死亡是胚胎正常发育所必需的 PCD和细胞凋亡常被做为同义词使用，但两者实质上是有差异的 • PCD是一个功能性概念，描述在一个多细胞生物体中，某些细胞的死亡是个体发育中一个预定的，并受到严格控制的正常组成部分 凋亡是一个形态学概念，指与细胞坏死不同的受到基因控制的细胞死亡形式 • PCD的最终结果是细胞凋亡，细胞凋亡并非都是程序化的。

  33. 2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究 ，获诺贝尔生理与医学奖

  34. 二、细胞凋亡的相关基因 （一）Fas受体是凋亡的主要引发剂 1、Fas受体基因 定位：10q23 结构：全长25kb 9个外显子 8个内含子 表达：跨膜蛋白 分布：外周血中活化的T、B细胞 又称作APO-1/CD95 属TNF受体家族

  35. 2、Fas配体基因 定位：1q23 结构：全长8kb 4个外显子 3个内含子 表达：类膜蛋白 Killer lymphocytes produce Fas ligand Binds to death receptor protein Fas Clustered Fas proteins recruit adaptor proteins These bind procaspase 8 These activate downstream procaspases, inducing apoptosis

  36. 3、作用 Fas受体与Fas配体的相互作用启动了细胞凋亡的通路 当载有Fas配体的细胞相互作用时，载有Fas受体的细胞将会发生凋亡

  37. 活化的Fas三聚体聚集 激活凋亡 Fas的聚集过程 • Fas能形成同源三聚体 • 三聚体在与配体作用前装配 • 配体的作用可能是引起三聚体装配成更大的聚合体 • FasL作用Fas时，一个聚集过程能使Fas激活通路的下游 Fas forms trimers that are activated when binding to FasL causes aggregation.

  38. Fas介导的细胞凋亡途径 Fas的特点 胞外区：三个富含半胱氨酸的 胞内区：死亡结构域（Death domain，DD） • FasL与Fas结合 • Fas三聚化使胞内的DD区构象改变，然后与接头蛋白FADD的DD区结合

  39. FADD的N端DED区（death effector domain）就能与Caspase-8（或-10）前体蛋白结合 形成DISC (death-inducing signaling complex ) 引起caspase-8、10通过自身剪激活 启动caspase的级联反应，使caspase-3、-6、-7激活，这几种Caspase可降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。

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