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Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen

Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen. SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT). Überblick. Einführung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang

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Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen

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Presentation Transcript

  1. Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)

  2. Überblick • Einführung • Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen • Grundlagen Kryokonservierung • Der Einfriervorgang • Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ • Kryobanken: Lagerung der Zellen • Kryokonservierung von hESC • Fallbeispiele • Probleme • Ausblick Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  3. Einführung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  4. Stammzellen I Embryonale Stammzellen (ESC)[1] • Besitzen mindestens zwei Eigenschaften: • selfrenewal durch asymmetrische Zellteilung • Pluripotenz Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm) • Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2] • Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten • Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  5. Stammzellen II Adulte Stammzellen • im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen • eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz) • Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc. IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen • Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden • bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht eindeutig bestimmt Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  6. Stammzellen III Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15]

  7. Gewinnung & Kultivierung ESC • Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste • Zerstörung der Trophoblasten durch Laserstrahl/Antikörper • Kultivierung [3]: • FeederzellenMonolayer (inaktivierte murine embryonale Fibroblasten) • Koloniewachstum -> 3D Struktur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  8. Forschungsziele • Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung) • Klinische Forschung • Zell- und Gewebeersatz • Immunsystemaufbau (HIV) • Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung • Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen Lagerung und Bereitstellung von hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  9. Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  10. Grundlagen Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2 • Der Einfrierprozess • Langsames vs. schnelles Einfrieren • Zellschäden durch extra- und intrazelluläre Eisbildung • Kryoprotektiva als Frostschutz • (im)permeable Substanzen • Lagerung der Zellen in Kryobanken • Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle [16] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  11. Der Einfriervorgang Zwei Einfriergeschwindigkeiten: • Langsam (Kristallisation) Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration)  Eutektisches Verhalten • Schnell (Vitrifikation) • Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt z.B. direkter Kontakt mit lN2  Übersättigte Lösung • unkontrolliertes Einfrieren Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  12. Kristallisation Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis dendritisches Wachstum der extrazellulären Wasserphase der Lösung  Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte [14] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  13. Vitrifikation Zelleffekte bei Vitrifikation Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt) • Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung aufgrund von iceseeding durch Membranporen Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]: Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  14. Kryoprotektiva Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben  Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  15. Kryobanken Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK StemCell Bank, HUES, …)  Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert • Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]: Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  16. Kryokonservierungvon hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  17. Vorbereitung • mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200 Zellen • Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit Feederzellen) • 10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat • Auswahl der geeigneten Abkühlrate • Resuspensionder Zellen in geeignetem Kryomedium [18] [17] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  18. Kryoprotokolle • Kontrolliertes Einfrieren Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren • Kühlrate variierbar • Schrittweises Abkühlen möglich • Reproduzierbare Protokolle • Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt  Vitrifikation Probe wird direkt in LN2 gefroren Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  19. Fall 1: Medium + 10 %DMSO Controlled-rate freezingofhESC[8] Kryomedium: 90% Kulturmedium + 10 % DMSO Kryosubstrat: 0,25 ml CassouStraw Kontrolle: I) ohne Kryokonservierung (Probe A) II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B)

  20. Fall 1: Medium + 10 %DMSO Vitalität • Kontrolliertes Einfrieren mit Iceseeding optimal • Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  21. Fall 2: Medium + Trehalose ImprovedcryopreservationofhESCwithtrehalose[4] Kryomedium: 90% Knockout serumreplacement+ 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose Kryosubstrat:0,5 ml Kryovial Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2 Kontrolle: 90% Knockout serumreplacement + 10 % DMSO

  22. Fall 2: Medium + Trehalose Differenzierungsstatus: • n = 75 Kolonien • Jüngere Passagen erholen sich besser nach der Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  23. Problematik • 3D-Struktur der hESC • Temperatur- & Kryoprotektivumgradienten • Verlust der Pluripotenz nach dem Auftauen • Dissoziation der Zellklumpen kann zu Zelltod führen • Zell-Zellkontakt unterbrochen durch extrazelluläre Eisbildung • Kryoprotektiva • Spezifische Auswahl wichtig • Toxizität bei Raumtemperatur • Proben & Arbeitsweisen • Verschiedene Zelllinien & Passagen • Unterschiedliche Handhabung der Kryokonservierung die optimale Kryokonservierung ist von vielen Faktoren abhängig Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  24. Ausblick • hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt: • regenerative Medizin • Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung • Individuelles Testsystem für Pharmazeutika • Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung Kryokonservierung ist ein vielversprechender , aber teilweise noch unausgereifter Ansatz für die Lagerung biologischer Proben Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  25. Dankeschön für die Aufmerksamkeit! Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  26. Quellen [1]: Human embryonicstemcells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007, 113: 5-10 [2]: Inductionofpluripotentstemcellsfrom adult human fibroblastsbydefinedfactors, Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5 [3]: EmbryonicStemCellLinesDerivesfrom Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145 [4]: Improvedcryopreservationof human embryonicstemcellswithtrehalose, Chun F. Wu et al., ReproductiveBioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739 [5]: The Banking andCryopreservationof Human EmbryonicStem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion medicineHemotherapy, 2007, 34: 293-304, [6]: A two-factorhypthesisoffreezinginjury: Evidencefrom Chinese hamster tissue-culturecells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 [7]: Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213 [8]: Controlled-rate freezingof human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson, Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 [13]: Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000 http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html [14]: Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual reviewof Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187 [15]: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc- pathway.Par.0001.Image.566.gif [16]: http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg [17]: Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg [18]: Kryostraws, http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

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