Cell culture

1. Cellculture Lab. Biochemistry D.V.M. Jeong

2. Cell growth • 세포의 크기나 구성물질의 증가만을 의미하는 것이 아니라 하나의 "mother" cell이 cell reproduction을 통해 2개의 daughter cell을 생성하는 증가 즉, 세포분열을 동반한 세포의 수적 증가를 의미

3. Cell growth 요구 조건 • - pH : 7.4 ~ 7.7 • - mixed gas : CO2(5%), O2 • - Osmolality : 260~320 mOSm/kg • - Temperature : 37℃ • - viscosity • - 기타 : 수분 및 증식할 수 있는충분한공간

4. 세포 성장 곡선

5. 세포 성장 단계 • ② lag phase(유도기, induction phase) • - 세포를새로운배지에접종, 배양할 때 그 배지에적응하는시기 • - 세포가새로운환경에서증식하는데필요한각종효소단백질을생합성하는시기 • - 세포의크기가커지고호흡활성도가높은시기 • - 세포내의RNA량은현저하게증가하고효소단백질합성이왕성한시기 • (DNA량은변화하지않음) • ③ logarithmic phase(대수기, exponential phase) • - 세포가대수적으로증식하는시기 • - 세대시간, 세포의크기가일정한시기 • - 세포질의합성속도와세포수의증가는비례 • - 증식속도는배지의영양, pH, 온도, 산소분압등의환경인자에의해서결정 • - 세포의생리적활성이가장강한시기 • - 물리적, 화학적처리에대해서감수성이높은시기 • ④ stationary phase(정상기, maximum phase) • - 살아있는세포의수는일정하게유지되지만전세포수는최대가되는시기 • - 일부세포가사멸하고다른일부의세포는증식하여사멸수와증식수가거의같다. • - 영양물질의고갈, 대사생산물의축적, 배지pH의변화, 산소공급의부족 등 부적당한 • 환경이되어살아있는세포수가증가하지않는다. • ⑤ death phase(사멸기, phase of decline) • - 살아있는세포의수가감소하는시기

6. 동물 세포 배양의 역사 • 1907년 Harrison이 올챙이의 척색에서 취한 신경섬유세포를 개구리의 응고 림프액에 배양함으로써 시작

7. 세포배양시 필요한 장치 • 도립현미경 (Inverted Microscopy) • CO2 incubator • Clean bench • 초순수 물 제조장치 • 배양 용기 • 액체 질소 보존통

8. 도립현미경 • 배양기 안에서 배양하고 있는 세포를 관찰하기 위하여 광원이 위에 있고, 대물렌즈가 아래에 위치 • 배율 : 40~200배

9. CO2 incubator • 액상 배지의 한 성분인 NaHCO3와 CO2 기체와의 평형에 의해 배지의 pH가 조절되므로 동물 세포 배양에는 CO2 incubator가 필수적 • 세포배양에 사용되는 CO2 incubator의 대부분은 water jacket 형으로서 문의 개폐에 따르는 온도변화가 작고 복귀속도도 빠르다. • Incubator 내부 가장 아래에는 배지의 습기 증발을 막기 위해서 가습 vat가 있어야 하며 늘 멸균수를 채워 넣어 내부 습도를 100%로 유지 • CO2 incubator는 고온다습하여 잡균의 오염가능성이 크기 때문에 무균 상태를 유지하도록 주의- Incubator의 내부는 1% SDS로 닦고 건조시킨 후 70% ethanol로 다시 한번 닦아냄- 가습용 vat의 물은 멸균수를 사용하고 방부제로 methyl p-hydroxybenzoic acid를 적당한 양으로 첨가

10. Clean bench • 무균조작을 위한 작업대 • HEPA filter 및 송풍기를 사용하여 무균공기를 항상 내부로 보냄 • Clean bench 내부에는 형광등과 자외선 살균등이 설치되어 있어야 하며, 사용하지 않을 때에는 항상 살균등을 켜놓아야 함- 사용한 후에는 작업대를 70% ethanol로 닦아야 함 • Clean bench 내에는 세포배양에 필요한 여러장비, 즉, autopipettor, aspirator (배양액을 원심분리한 후 배양상청액을흡취하는데 사용한다), forceps, micropipetter, burner, pipette (1ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, etc.)등을 둠- 일반적으로 burner는 pipette과 배지 병의 입구등을 화염멸균할 때 사용하지만 무균조작 자체를 신중히 하면 화염멸균이 반드시 필요한 것은 아님.

11. 배양 용기 • 유리제- 부유세포 : 문제 없음. - 접착세포 :유리제에collagen, poly-D- lysine, fibronectin등의 접착인자를 coating하는 전처리 과정 필요 • 플라스틱제- 일반적으로 일회용- 세척, 멸균 등의 작업이 필요없음

12. 플라스틱제 배양용기 특징

13. 액체 질소 보존통 • 세포의 장기 보존을 위해 액체 질소 보존통 이용 • 액체 질소 보존법- 액체 질소 용액 내 보존(-196°C)- 액체 질소 증기 내 보존(-120°C)이 있다. • 액체질소 용액 내 보존은 액체질소가 동결앰플(ampule) 내에 침투할 경우 바이러스 등의 오염의 원인이 되고, 해동시에는앰플내의 액체질소가 기화하여 폭발할 위험이 있음- 액체질소 용액 내에 보존을 할 경우 silicone rubber에 packing이 붙어 있는 플라스틱제의 cryotube를 사용하거나 또는 유리앰플에 봉합하여 사용하는 것이 바람직 • 액체 질소 보존법은 거의 반영구적으로 보존이 가능하지만 일년에 한번은 해동하여 배양하고 다시 동결 • 액체질소는 기화하여 감소하기 때문에 정기적으로 보충할 필요가 있음

14. 살균용 ethanol의 농도 • 무균 조작 시 사용하는 ethanol의 농도는 70%가 일반적이다. 분무기에 미리 준비하여 사용하는 것이 좋으며 70% ethanol을 뿌려 살균한 후에 남아있는 잔여물은 autoclaving 등으로 미리 무균화된 거즈로 닦아낸다.

15. 부착 세포 배양과 부유 세포 배양 • 부착 세포 배양 • Extracellula Matrix (ECM) • 부유 세포 배양 • Cell dissociation

16. 부착세포 배양 • 대부분의 고형 조직 유래의 세포는 단층으로 부착하여 증식- 이러한 세포는 대부분 약한 음전하를 띤 유리 용기 또는 적당한 전하를 띄도록 처리된 polystyrene과 같은 플라스틱 용기에 부착하여 증식 • 세포의 부착은 extracellular matrix (ECM) protein에 대한 specific cell surface receptor에 의해 매개(ECM에대하여 조사) • 부착 세포에는 fibroblast-like cell, endothelial cell, epithelial cell, mesenchymal cell등이 해당되고 어떤 경우에든 부착하기 전에 세포로부터ECM protein이 합성 및 분비되어야 하며 그렇지 않을 경우에는 표면이 ECM protein으로 처리된 substrate가 제공되어야 함 • cell-cell그리고 cell-substrate의 부착은 cell surface receptor와 ECM protein에 의해 이루어지며 이 과정에서 Ca2+ ion이 중요하게 작용- 계대 배양 시 protein의 분해와 Ca2+ chelation을 이용하는 경우가 많음.

17. ECM • cell-cell adhesion molecules- CAMs(cell adhesion molecules) (Ca2+-independent), cadherins (Ca2+-dependent) • Integrin • transmembraneproteoglycan

18. 부유세포배양 • Leukemia와 murineascite tumor cell들은 지속적으로 부유 상태로 증식 • 부유 세포 배양은 세균과 유사하게 계대 배양함.- 탈착 과정(trypsin처리 등)을 필요로 하지 않으며 전체적으로 부착보다 시간이 더 적게 소요- 세포를 유지하기 위해서는 주로 배양 세포를 희석시킴으로서, 또는 계대배양없이 단순히 배지의 양을 증가시킴으로써 지속적으로 배양- 부유 배양에서는 배양액의 희석을 지속적으로 하여 세포 농도가 항상 일정하도록 유지할 수 있다면 세포 증식의 steady state에

19. Cell dissociation

20. 세포의 동결 보존 • 세포 배양시 보통 10000:1의비율로 돌연변이체가 생기며 장기간에 걸쳐 계대 배양을 계속하게 되면 본래의 세포 집단과는 전혀 다른 세포 집단으로 변질- 유전적 변이를 최소화하고 노화와 형질전환 등을 방지하기 위하여 동결 보존 필요 • 세포의 동결 보존시 세포에 내동성을 부여하기 위해서 dimethylsulfoxide (DMSO) 또는 glycerol을 첨가하는데, glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려짐. - Freezing medium에 포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 동결 조작은 신속하게 진행해야 함. • (glycerol과 DMSO의내동성 부여 방법???) • 동결 보존할 세포는 보존 전에 오염 여부를 확인하여야 하고 대수 증식기(log phase)에 있는 활성적인 세포를 이용 • 동결 시 감온 속도는 세포에 따라 다르며 보통 -1°C/min 속도로 동결 • Programmed cooler를 이용하거나 또는 솜을 채운 ice box에 저장할 세포가 포함된 vial을 넣고 -70 ~ -90°C의 deep-freezer에 정치한 후 액체 질소로 옮김으로써 동결 보존 완료

21. 동결 보존된 세포의 배양 • 동결된 세포는 저온과 DMSO에 의한 장해를 피하기 위해서 신속히 조작- 액체 질소에 저장 상태인 동결 세포 vial은 액체 질소에서 외부로 나오는 즉시 37 - 40°C 정도의 수조에서 신속히 해동하고, 미리 준비한 배지에 세포 현탁액을 넣어줌- DMSO나 glycerol을 제거하고자 할 경우에는 80 xg에서 2 - 3 분간 원심하여상청액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁한 후 배양 용기에서 배양- 이때 보통의 계대 배양 때보다 높은 세포 접종 밀도로 배양을 시작하고 다음날 반드시 배지 교환 • 부착 세포의 경우(37°C에서 배양하는 세포의 경우) • 부유 세포의 경우(37°C에서 배양하는 세포의 경우)

22. subculture(계대배양) • - 세포들은일정량의영양성분을일정공간내에서공급받으며증식하고 contact inhibition의특징을가지고있기때문에무한정배양이불가능하다. 따라서세포들을계속증식시키기위해세포일부를배양용기에서떼어내어새로운배양접시에넣고 배 양을하는subculture를필요로한다. •  - 대부분의세포는분열횟수가증가함에따라세포노화(culture senescence)현상이나타나 고 세포의성질이시간에따라변화하기때문에일정횟수만큼만subculture를 할 수 있다. 하지만돌연변이에의해세포성질이변하여장기간subculture가가능해진세포 가 있을 수 있는데이를 cell strain, 무한정subculture가가능해진세포를 cell line이라 고 한다. •  - subculture는배양액의 pH, 세포밀도, 세포형태나색소·기포형성등을관찰하여 그 시기 를 결정한다. • contact inhibition ? • - cell population이너무커져서cell과 cell 이 조밀하게맞닿을경우 cell 성질에변화를주고성장이방해받는현상

23. 부착 세포의 경우(37°C에서 배양하는 세포의 경우) • 1 .37°C 수조에서 배지를 미리 항온한다. • 2 .동결 보존 세포를 포함한 vial을 액체 질소에서 꺼내는 즉시37°C 항온 수조에서 재빨리 해동시킨다. • 3.DMSO나 glycerol을 제거하고자 할 경우에는 80 xg에서 2 - 3분간 원심하여상청액을버리고새로운 배지에 세포를현탁한다. - DMSO나 glycerol을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에 세포를 현탁한다. • 4 .배양 용기에서 배양한다. • 5 .다음날 새로운 배지로 교환한다. • 6 .현미경으로 세포를 관찰하며 2 - 3일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포가 배양 용기를 꽉 채우게 되면 계대 배양한다.

24. 부유 세포의 경우(37°C에서 배양하는 세포의 경우) • 1 .37°C 수조에서 배지를 미리 항온한다. • 2 .동결 보존 세포를 포함한 vial을 액체 질소에서 꺼내는 즉시37°C 항온 수조에서 재빨리 해동시킨다. • 3 .DMSO나 glycerol을 제거하고자 할 경우에는 80 xg에서 2-3분간 원심하여상층액을 버리고 새로운 배지에 세포를 현탁한다. - DMSO나 glycerol을 제거하지 않아도 될 경우에는 원심하지 않고 새로운 배지에 세포를 현탁한다. • 4 .배양 용기에서 배양한다. • 5 .다음날 새로운 배지로 교환한다.- 이때는 원심하여 배양액을 버리고 새로운 배지로 세포 침전을 현탁하여 배양용기에서 배양한다. • 6. 현미경으로 세포를 관찰하며 2 - 3일마다 새로운 배지로 교체해주고 세포의 개수를 측정하여 일정 수준 이상이 되면 계대 배양한다.

25. 부착 세포의 계대 배양 • 1. 배양 배지를 제거한다. • 2. Ca2+와 Mg2+가 포함되지 않은 D-PBS (JBI, Cat. No. LB 001-02) 또는 HBSS (JBI, Cat. No. LB 003-03 또는 LB 003-04)로 세포층을 씻어 낸다. • 3. Cell dissociation reagent (i.e. trypsin또는 trypsin-EDTA, EDTA soluton)를 처리한다. • 4. Cell dissociation reagent를 제거하고, 배양 용기에서 세포가 탈착될때까지 상온 또는 37°C에서 2 - 10분간 정치한다. • 5. 현미경으로 세포의 탈착을 확인한 후 새로운 배지로 세포를 현탁한다. - 이때 새로운 배지에 혈청이 포함되어 있다면 위의 trypsin을 완전히 제거할 필요가 없지만 serum-free media나 protein-free media를 사용할 경우에는 trypsin inhibitor를 사용하거나balance salt solution으로 여러 번 세척하여 trypsin을 제거한 후 새로운 배지로 현탁한다. • 6. 세포수를 측정한다. • 7. 적절한 세포 밀도가 형성되도록 세포 현탁액을 취하여 새로운 배지로 희석한 후 배양한다. • 8. 더 이상 배양할 필요가 없을 때 동결 보존한다. - 세포의 동결 보존시에는 세포에 내동성을 주기 위해서 DMSO나 glycerol을 5 - 10% 첨가하는데 glycerol 보다 DMSO가 더 효과가 있는 것으로 알려져 있으며 일반적으로 동결 배지에   포함된 DMSO는 세포에 독성을 나타낼 수 있으므로 조작을 신속하게 해야한다.- 세포는 -1°C/min 속도로 동결하며 최종적으로는 액체 질소에 저장한다.