1 / 42

Elektroforese

Elektroforese. Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner. Begreper. Elektroforese ; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt Iontoforese (små molekyler / ioner) Sone-elektroforese (protein, DNA)

carl
Download Presentation

Elektroforese

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner

  2. Begreper • Elektroforese; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt • Iontoforese (små molekyler / ioner) • Sone-elektroforese (protein, DNA) • Elektroferogram (densitometri) • Amfolytt

  3. Amfolytt - +

  4. Vandring i et elektrisk felt • Molekylets netto ladningen er avhengig av pH (amfolytter) • Vandringshastigheten er proporsjonal med netto ladning, og omvendt proporsjonal med størrelse og viskositet Q μ = 6 · π · r · η

  5. Skjematisk elektroforese-oppsett • Elektrisk feltstyrke • Molekylets beskaffenhet • Bufferen • Støttemedium • Temperatur og fordamping

  6. Det elektriske feltet • Ohms lov: U = R · I • Effekt: E = U · I • Elektrisk feltstyrke: F = U / L [Volt/cm] • Varmeutvikling: U · I · t • Konstant spenning / strømstyrke / effekt / pulsed-field

  7. Bufferen • Bufferionene ”bærer” strømmen • pH; bestemmer molekylenes total-ladning • Ionestyrke og konsentrasjon; bestemmer migrasjonsrate og oppløsning • Valens og ionestørrelse • Viskositet

  8. Jo høyere ionestyrker, desto større ionesky => • lavere migrasjonshastighet og • høyere oppløsning, men større varmeutvikling.

  9. Påsetting av prøve på gel Submarin applisering ”Loading”-buffer Applisering på gel

  10. Støttemedium; ønskede egenskaper: • Ikke påvirke mobiliteten til buffer-ionene • Stabilisere stor væskemengde i mediet • Ikke være løselig i bufferen • Inert for prøvemolekylene • Porestørrelse tilpasset ønsket separasjon • Homogen struktur • Lavt egenpotensiale; elektroosmotisk flow

  11. - - - - - - - - - - - Elektroosmotisk flow / Elektroendosmose Buffer Protein Katode + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + + - + - + - + + - + - + - + + - + + - - + + + - + - + + + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Anode - + - • - - - - - - - - - - - - - - - - - - Overflate på en geltråd

  12. Separasjonsbetingelse • Molekylets ladning / masse ratio • Molekylstørrelse vs. porestørrelse Gelmaterialer • Agarose • Polyakrylamid PAGE • (Stivelse, celluloseacetat, papir)

  13. Agarose • Store porer ved 0,5 – 1 % agarose • Ladning/masse-ratio • Klar • Lite elektroendosmose • Egnet for proteiner og for DNA-fragment (< 20 kbp)

  14. Polyakrylamid • Kjemisk inert • Nærmest ingen elektroendosmose • Klar • Termostabil • Porestørrelse etter behov • Ladning/masse-ratio og molekylstørrelse • Egnet for små DNA-fragment (<1 kbp) og denaturert protein (SDS-PAGE) • NB! Monomeren er svært giftig

  15. «Native» elektroforese • Elektroforese under denaturerende betingelser

  16. Temperatur og fordamping

  17. Liggende vs. stående gel

  18. Visualisering ved gelelektroforese • Fiksering • Farging • Avfarging • Momenter å ta hensyn til: • Diffusjon i gelen • Spesifikk farge for det en ønsker visualisert • Bakgrunnsfarge minst mulig • Farges alle typer proteiner likt? • Fargeopptak / fargeintensitet • Egnethet for densitometri / deteksjon

  19. Serumprotein-elektroforese Elektroforogram Agarose-gel

  20. Spinalvæske- og serum- elektroforese Høyere oppløsning Mer sensitiv farge

  21. Hemoglobin-elektroforese Ulik vandring ved forskjellig pH Ulike fargevalg pH 8,6 pH 4,5

  22. Lipoprotein-elektroforese i serum Lipid-farge benyttet HDL VLDL LDL Chylomikroner

  23. Elektroforetisk separasjon av DNA-fragmenter Farget med etidiumbromid Fluorescens fotografert Stige

  24. Isoelektrisk fokuseringSeparasjon på ulik pI

  25. Todimensjonal elektroforese (2D-elfo)

  26. Kapillærelektroforese

  27. Kapillærelektroforese; Kapillæret fylt med buffer; Separerer på ladning Katode - Anode +

  28. Kapillær gelelektroforese Kapillæret fylt med polymer Separerer på størrelse Katode - Anode +

  29. ”Blotte”-teknikker • Western blotting (protein + antistoff) • Southern blotting (DNA + DNA-probe) • Northern blotting (RNA + RNA-probe) • 1. Elektroforese • 2. Blotting • 3. Spesifikk merking • 4. Visualisering

  30. Elektroforese

  31. Blotting

  32. Spesifikk merking og visualisering

  33. Eksempel: Western blotting av celle- og tumorlysater, antistoffer mot fosforylert-Akt (rød) og total-Akt (grønn) fremkalt i NIR-skanner. 125 kD 100 83 59 44 37 25 20 15 7,5 Stige Αkt/p-Akt (60 kD)

More Related