1 / 50

Zápočet

Zápočet. Prezentace Minimální počet bodů z testů – 23 Kdo nemá Přijde v zápočtovém týdnu ve středu v 9: 45 do této posluchárny a napíše si 1 až více testů z přednášek, na které test nepsal, nebo z těch, ze kterých má nejméně bodů Kongresová hala, aula v 9:45 3 termíny 22 .1.2014 (středa)

caron
Download Presentation

Zápočet

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Zápočet • Prezentace • Minimální počet bodů z testů – 23 • Kdo nemá • Přijde v zápočtovém týdnu ve středu v 9: 45 do této posluchárny a napíše si 1 až více testů z přednášek, na které test nepsal, nebo z těch, ze kterých má nejméně bodů • Kongresová hala, aula v 9:45 • 3 termíny • 22.1.2014 (středa) • 5.2.2014 (středa) • 18.2.2014 (úterý) Zkouška

  2. Viry a mobilní DNA Viry – kapitola 21 Mobilní DNA – kapitola 22

  3. Viry • Buněční parazité kompletně závislí na hostitelské buňce • Neexistuje aparát pro translaci, replikaci a pro tvorbu ATP • Virová částice (virion) obsahuje DNA nebo RNA a je obalena proteinovým kabátem (kapsida) • Being alive (virus) vs. living cells • DNA – genetická informace • RNA – poslíček • Ribozomy – translace • Proteiny – výroba ATP • Membrány – strukturní integrita

  4. Morfologie viru • Kapsida (kapsidový protein – je kódován virem) • NK • Šroubovité vláknité viry • 5-10nm v průměru • Dlouhé až 1000nm • NK vázáná ze vnitř • Ikosaedrické viry • Dvacetistěn • Kapsida T1 - 60 molekul jednoho proteinu (2-5kb) • Kapsida T4 – 240 molekul (pojme přes 10kb) VIRION

  5. Morfologie viru • Komplexní struktura • Kolem kapsidy ještě obal z napadené buňky (viry savčích buněk) • Pučí z membrány, do které byl zabalen virový protein • Bakteriofág • Ikosaedrická hlavička • Šroubovitý bičík • Vlákna • basální destička

  6. Variabilita virového světa • Infikují bakteriální, rostlinné a živočišné buňky • Nejmenší virus má pouze 3 geny, nejkomplikovanější virus má 200-300 až 900 genů • Mimivirus • Největší známý virus • Isoheadrický, 0,75uM • 1,2Mbp genom, 900 genů • Bakteriofág G • Infikuje Bacillus megaterium • Obsahuje 700 genů

  7. Variabilita virového světa 3‘ 5‘ • ssDNA/dsDNA nebo ssRNA/dsRNA viry • Lineární nebo cirkulární • Replikace pomocí otáčivé kružnice • u lineárních dojde k cirkularizaci DNA/RNA • Syntéza druhého vlákna u ssDNA/ssRNA virů • Replikační forma • RNA viry si kódují svou vlastní RNA polymerázu, reverzní RNA transkriptázu RNA- mRNA/RNA + DNA 5‘ 3‘

  8. Virový genom • Minimálně 3 geny • Kapsidový • Pro průnik do buňky • replikační • Nejčastější velikost genomu je 8-20kb (6-15 genů) • 3 typy virů • RNA viry – replikují se RNA polymerázou • Retroviry – replikují se střídaním transkripce a reverzní transkripce • DNA viry – replikují se DNA polymerázou ssRNA viry, bakteriofágy, 3kb

  9. RNA viry • Výhoda – RNA ihned připravena k translaci ( ne u minus RNA virů) • V cytoplasmě (vyhnou se jádru plného různých enzymů na úpravu RNA) • Nevýhoda • RNA polymerace pomocí RNA dependentní RNAP (nevyskytuje se v buňce) • Syntéza minus vlákna, které musí být odstraněno při sbalování do kapsidy • Nemohou si dovolit příliš velké genomy – chyba RNAP je 1/10kb • Maximální velikost genomu je 20kb • RNA dependetní RNAP se v buňce neyskytuje – nemohou se spoléhat na buněčný aparát • Chybějí ssRNA vazebné proteiny, helikáze atd

  10. Replikační strategie RNA virů • Vlastní RNA dependentní RNA polymeráza • V cytoplasmě • Obvykle kódují 3-8 proteinů • Problémy: • Některé geny je třeba přeložit častěji než jiné • Polyproteinová strategie (autokatakytický sestřih vlastních proteinů) (picornaviry) • Ignorace stop kodónů a start kodónů • Subgenomová mRNA (alphaviry) • Virová mRNA je „přitažlivější“ pro ribozom než vlastní mRNA • Plus RNA musí mít čepičku již od bývalého hostitele • Minus RNA – dojde k replikaci ( k segmentaci) a k přidání čepičky (virová RNAP – 2000AA, polyfunkční) • Replikace virové RNA • RNAP • Fungují současně jako helikázy a SSB

  11. Pozitivníss RNA viry • Picornaviry • Obrna, nachlazení, hepatitida A, kulhavka a slintavka • +RNA je využíváno k translaci (bezčepičková translace) • Má 3‘ poly A konec • 5‘ konec je chráněn proteinem Vpg nahrazující čepičku (nutný pro replikaci), pro translaci je důležitá sekvence 150 – 600bp poté • Viry kódují proteázu štěpící CBP faktor-vyřadí tím všechny buněčné mRNA • Je vytvářen polyprotein, který je následně naštípán na 10 – 20 proteinů

  12. Replikace + ss RNA viru • The Alphavirus life cycle • Průnik do buňky endocytózou • Virový genom je vpuštěn do cytoplasmy • 1 nestrukturální polyprotein (nsPs) je přepsán • nsP1 – syntéza negativního vlákna • nsP2 – RNA helikáza, proteináza – zastavuje transkripci hostitele • nsP3 – replikáza • nsP4 – RNAP • 4. Syntéza celého minus vlákna • - templát pro syntézu subgenomické RNA • - polyprotein C-pE2-6K-E1 • - templát pro syntézu genomické RNA • 5. Sbalení virové částice a vypučení ven Biology and pathogenesis of chikungunya virus Olivier Schwartz & Matthew L. Albert

  13. Negativníss RNA viry • Evolučně velmi mladá skupina virů • Velmi virulentní • Vzteklina, spalničky, příušnice, chřipka, Ebola etc. • Vnější membrána je odvozena od membrány hostitelské buňky • Musí si přinést svou RNAP • Genomová RNA má na svých koncích vždy invertované repetice 15 -20bp dlouhé • N-P-M-G-L geny (na + řetězci) • Protein N • povrch kapsidy • Anti-terminační účinky • Až 100x více než proteinu G Messenger RNA Cap Methylation in Vesicular Stomatitis Virus, a Prototype of Non‐Segmented Negative‐Sense RNA Virus Jianrong Li1, 2, 3 and Yu Zhang1

  14. dsRNA viry • dsRNA viry • Poměrně vzácné • Asi 12 kusů dsRNA, každý kóduje jeden protein • Rotaviry • Replikační komplexy jsou uvnitř kapsidy

  15. DNA viry • Vyvíjejí se v jádře buňce a využívají běžných buněčných mechanismů pro replikaci a transkripci • Většina DNA virů napadá obratlovce • Musí se vyrovnat se striktní kontrolou buněčného cyklu • Virus bývá schopen produktivní infekce jen za nepříznivých okolností a v omezeném spektru tkání • Většinou je infekce latentní Transformace buněk – oslabení kontroly buněčného cyklu směřující k neomezenému množení Začlenění DNA viru do genomické DNA

  16. dsDNA viry • dsDNA viry baktérií • typický baktériofág • T4, lambda, P1, Mu • dsDNA viry vyšších organismů • Papaoviry (polyoma a papiloma) • Nejmenší dsDNA viry (5kb) • T-antigen • Protein ovlivňující buněnčný cyklus (vyvazuje p53 protein, vstup do S fáze) • Při dostatečném množství iniciuje replikace virového genomu • Latentní infekce vedou ke vzniku nádorů • Herpesvirus • Opar, sexuálně přenosný herpes, plané neštovice, mononukleózu • Největší jaderné DNA viry (150 – 230kb) • Obrovský arsenál vlastních proteinů • Latentní herpesviry

  17. DNA viry • dsDNA viry vyšších organismů • Poxvirus • Velmi komplexní (150 – 200 genů) • viditelné pod světelným mikroskopem (0,4 -0,2 uM) • K replikace dochází v cytoplasmě buňky (jako jediný DNA virus) • V kapsidě má svou RNAP, 2-3 transkripční faktory, 3 enzymy pro syntézu a metylaci čepičky, DNA topoisomerazu, DNAP • dsDNA viry rostlin • Poměrně vzácné • CMV virus – cauliflower mosaic virus

  18. Bakteriální virus - bakteriofág • Objeveny v roce 1917 • Phage – řecké slovo pro „ jíst“ • Využívány hojně v molekulární biologii • Bakteriofág  - nejvíce studovaný organismus • Pouze DNA/RNA vstupuje do buňky • 1952 – pokus s bakteriofágem ukazující, že DNA je nositelem genetické informace • Fágové – nejpočetnější skupina živé formy • 1030 baktérií, každá má 10 fágů • 1031 fágů • Mořská voda – 50x106 virů na 1 ml • Ničí 40% baktérií denně – koloběh uhlíku

  19. Životní cyklus viru • Navázání se na buňku • Vstup do buňky • Vstupuje pouze DNA/RNA (rostlinné a bakteriální viry) • Vstupuje cely nukleokapsid (živočišné viry) • Replikace virového genomu • Výroba virových proteinů • Sbalení nových virových částic • Uvolnění z buňky

  20. Životní cyklus viru • Vstup do buňky • Vstupuje pouze DNA/RNA (rostlinné a bakteriální viry) • Vstupuje cely nukleokapsid (živočišné viry)

  21. Životní cyklus viru • Ranné geny • jejich promotory připomínají promotory hostitelské buňky • kódují proteiny důležité pro replikace • Pozdní geny • u některých virů jsou tyto geny přepisovány virovou RNA polymerázou • kódují proteiny kapsidy

  22. Expresní strategie dsDNA fágů • 95% všech fágů • Proces infekce: • Časná fáze • Slabá transkripce časných genů bakteriální RNAP • Transkripční geny • Geny interferující s retričkním systémem baktérií • Proteiny zabraňující superinfekci • Střední fáze • Transkripce hlavních fágových replikačních proteinů • Pozdní fáze • Intesivní replikace fágové DNA • Silná exprese kapsidových proteinů

  23. ssDNA viry baktérií • Bakteriofág X174 • 5386 bp, 11 genů • 5 genů se překrývá • Gen D a gen E • Gen D důležitý pro sbalení kapsidy • Gen E rozrušuje bakteriální stěnu a umožňuje uvolnění viru z buňky • Bakteriofág M13 • Dlouhé filamentum • Infikuje pouze F baktérie • M13 virus nezabíjí baktérie, používá se na přípravu ssDNA

  24. Lytický vs latentní cyklus • Virus integrovaný do genomu – provirus, prophage • Integrace do genomu může být přes definovaná místa ( attachment site), nebo náhodná 20-40 minut 10 – 100 fágů Plak 4-10mm

  25. Louis Pasteur ( 1822 – 1895) • Zakladatel moderni lékařské mikrobiologie • pasterizace/sterilizace • podpora teorie, že za nemocí stojí choroboplodné zárodky • První vakcinace za použití laboratorně oslabeného organismu (viru, či bakterie) • Vakcína proti anthrax a vzteklině

  26. Eradikace neštovice • Edward Jenner (1749 – 1823) • Virus Variola major, V. minor • 20. století – 300-500 milion lidí umírá • 26.10. 1977 – poslední případ • 9.12. 1979 - eradikace • 1986 – konec očkování • 2 vzorky stále na světě (CDC, Atlanta a State Research Center for Virogology, Koltsovo, Russia) • Nebezpečí použití jako biologické zbraně

  27. Vítězství nad obrnou • Jonas Salk (1914 – 1955) • virolog • Vakcína proti dětské obrně • Obrna patřila mezi nejobávanější nemoci poválečných let • 1952 – 58 000 případů obrny • 1954 – klinické testy, nejrozsáhlejší vůbec (1 800 000 dětí se účastnilo testů) • 12.4.1955 - vakcína funguje • 1962 – orální vakcína (Albert Sabin)

  28. Mobilní elementy - transpozony • Mobilní DNA – dochází k přesunu DNA v rámci jedné DNA, nebo mezi DNA jádra • Skákající geny – proces je nazýván transpozice • Transpozony nejsou nikdy samostatně • Transpozony • DNA (cut and paste transpozice) • Retroposony (copy and paste transpozice) • Způsoby transpozice • Konzervativní (cut and paste) • Replikativní (copy and paste)

  29. DNA transpozon • Inerzní repetice na svých koncích • 9-40 bází • ORF 1kb – transponáza • Frekvence transpozice je 1/1000 až 1/10000 na 1 transpozon na buňku • Cílová sekvence – rozpoznávána transponázou • 3-9bp • Transponózy nesou geny pro resistenci na antibiotika, virulentní geny, metabolické geny

  30. Cut and paste transpozice • Nereplikativní, konzervativní

  31. Replikativní transpozice • Více komplexní transpozice • Resolváza rozeznáva interní místo • Částečně palindromická sekvence 30-40bp • Dochází k replikaci transponózu

  32. Bakteriální transpozony • Nejjednodušší transpozóny • Inserční sekvence – IS • IS1, IS2 atd. • 750 – 1500 bp dlouhé, repetitivní konce jsou 10 – 40bp • Pouze cut-paste transpozice • Regulovaná transpozice pomocí regulačního proteinu A • Neregulovaná transpozice by vedla ke zničení chromozómu • F-plasmid obsahue IS2 a IS3 - transpozice

  33. Regulace transpozice Tn10 • Bakteriální transpozón • Kompozitní transpozón nesoucí gen pro resistenci na tetracyklin • Transpozice nereplikativním způsobem • Transpozice je silně regulována • Antisense RNA (transript z Pout se překrývá s Pin • Mutace transponázy v IS1 OL • Transpozice je inhibován dam methylací (GATC sekvence promotoru transponázy, k transpozici docházi v pouze momentě replikace, kdy DNA není methylována) Transponáza zmutovaná 1-10% aktivity Transponáza plně funkční

  34. Bakteriofág Mu • Virus vs transpozón • Genom 38kb • Po infekci se integruje do genomu pomocí nereplikativní transpozice • Promotory replikačních genů jsou zareprimovány represorem • Fág je stabilní a nepřesouvá se • Vhodný podnět (SOS reakce) – ranný promotor se odblokuje, nastane silná replikativní transpozice, přemístí si až 100x • Odblokuje se i pozdní promotor – syntéza kapsidových proteinů

  35. Transposony vyšších organismů • Barbara McClintock (1951) • Ac/Ds rodina transpozonů • Ac – aktivátor • Ds - disociátor • Repetitivní konce 11 bazí • Cílová sekvence – 8bp • Ac element je 4500bp, plně funkční • Ds element je defektni Ac element

  36. Další typy DNA transpozónů • P elements – Drosophilla melanogaster • M kmen – v laboratoři od 1905 • P kmen – v přírodě • Křížením M kmene (samice) a P kmene (samce) – sterilní potmostvo • V M kmenech v somatických buňkách se translatuje represor • Tc1/Mariner like transpons – všude, nejběžbější typ transpozónu • Sleeping beauty transpozon (usnul před 10-15 milióny let) • Transpozóny obratlovců jsou většinou zmutaované a nefunkční • Zrekonruován původní transpozón – velmi aktivní • „virulence“ transpozónů klesá v průběhu evoluce

  37. RNA transpozóny - retroposony • Původní RNA transkripce, která se reverzní transkripcí změnila na DNA a integrovala do chromozómů • Po transkripci své DNA jsou schopni transpozice – kódují si vlastní RT • Retroposon je transpozon, který je mobilizovaný ve formě RNA, která musí být přepsána do cDNA • Transponová RNA kje v jádře volná a tudíž umožňuje transpozici do vzdálených míst • Musí kódovat transponázu • Musí kódovat RT • Případně proteiny chránící před všudepřítomnými Rnázami • Proteiny, které umí zabalit RNA a chránit ji retroviry • Virová (LTR) nadrodina • Nevirová (non LTR) nadrodina • U rostlin a živočichů představují až 50% genomu

  38. Retroviry • Vir obsahuje ssRNA (pozitivní) • Především u ptáků a savců • V hostitelské buňce může být integrován do DNA • Reverzní transkriptáza • Nejpůvodnější a nejprimitivbější • Je velmi pomalá a chybující, bez korektury • Templát je okamžitě degradován (Rnase H aktivita) • LTR – long terminal repeats • Jde proti centrálnímu dogma molekulární biologie

  39. Replikační cyklus retroviru integráza Nikdy nedochází k translace retrovirové RNA Virus si přináší reverzní transkriptázu Integrázu tRNA Reverzní transkriptáza

  40. Genom retroviru • Gag – kapsidové proteiny • Matrixový • Kapsidový • Nukleokapsidový – váže virovou RNA • Pol – enzymy • Proteáza • Reverzní transkriptáza • integráza • Env – obalové proteiny • povrchový protein • Transmembránový protein Unikátní U5 sekvence + PBS sekvence Silný promotor v U3 oblasti Pouze jeden – retrovirus kombinuje strategii subgenomových mRNA s polyproteinovou

  41. Replikace retrovirů RNA DNA PBS sekvence Spárování Strong stop minus DNA Dlouhý usek pyrimidinů, který není schopna RT rozštípat

  42. LTR retroposony • Velmi podobné retrovirům, jen nemají (ztratili, nebo ještě nezískali) ORF pro env • Ty elementy kvasinky • Ty1, Ty2, Ty3, Ty4 a Ty5 • Jejich transkripty představují as 5% veškeré mRNA v buňce • ~6.3 kb, 330 dlouhé LTR • Frekvence transpozice 10-7 az 10-8 • Copia elementyD. melanogaster • ~5000bp, 276 dlouhé LTR • 20 – 60 kopií na buňku • Frekvence transpozice 10-3az 10-4

  43. Non LTR retroposony • Nevirové • Sestřihové pseudogeny • Úseký, odpovídající cDNA kopii transkriptu RNA (někeré mají dokonce poly A/T) • Nejsou funkční • nejsou hojné (pouze 0,5% genomu člověka) • LINES – long interspersed nuclear sequences • SINES – short interspersed nuclear sequences

  44. LINES • Genomové cDNA kopie transkriptů RNAP II a III • Jsou velmi hojné, velmi příbuzné • K transpozici L1 dojde u 10 z 250 lidí (pouze v zárodečné linii) • 2 ORF • RNA vazebný protein • RT s nukleázou

  45. SINES • cDNA kopie transkriptů RNAP III • Až milióny kopií v genomu • Tvoří významnou část repetitivní DNAjsou náhodně roztroušené • Nejznámější tzv. Alu sekvecne (300bp) • Replikace a integrace LINES a SINES

  46. Význam transpozónů v lidském genomu

More Related