Определение чужеродного генетического материала в продуктах питания

1. Определение чужеродногогенетического материала в продуктах питания Рекомендации 2007

2. Правильно ли вы определяете ГМО?

3. Введение Основы определения ГМО Критические замечания по определению ГМО Topics of Talk

4. Темы Процедура анализа ГМО Размер образца и аналитический образец Экстракция и очистка ДНК ПЦР: Специфичность, LOD и определение количества Контроль качества Контроли ПЦР Внутренние контрольные образцы

5. Маркировка ГМО 0.9% Толерантность к контаминация неизбежными/случайными разрешенными ГМО 0.5% Толерантность к не авторизованным безопасным ГМО контаминациям Ноль Нулевая толерантность к запрещенным ГМО Контроль ГМО и правила маркировки Европейскаямаркировка ГМО и пороговая толерантность

6. Кабинет Министров Украины постановлением от 13 мая 2009 г. N 468 «Про утверждение Порядка маркировки пищевых продуктов, которые содержат генетически модифицированные организмы или сделанные с их использованием и вводятся в оборот» установил: «Етикетування харчових продуктів, які містять генетично модифіковані організми обсягом понад 0,9 відсотка або вироблені із сільськогосподарської продукції, вміст генетично модифікованих організмів у якій становить понад 0,9 відсотка, повинне проводитися їх виробником (постачальником) із зазначенням відповідної інформації.» Файл:

7. Нормальная клетка Трансген Два подхода к анализу ГМО Определение новых генов ПЦР Определение новых белков иммуноанализом Трансгенная клетка

8. Основные принципы ПЦР ГМО содержат уникальные последовательности ДНК Ключ к процедуре поиска: “праймера” Высокая чувствительность поиска связанна с процессом умножения в ПЦР

9. Распознавание Праймеров (Реакция гибридизации)

10. Количество циклов ПЦР 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40 Количество молекул ДНК 1 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 1,000,000 1,000,000,000 1,000,000,000,000

11. Специфичность ПЦР Подтверждение специфичности праймеров Образцы 1-10: Walnut, Hazelnut, Peanut, Pecan, Prune, Apricot, Nectarine, Pear, Strawberry, Pistachio

12. Анализ ПЦР Высокая чувствительность Высокая специфичность Работает со всеми ГМО (все ГМО содержат новые гены) Определяет количество ГМО % Высокая эффективность с широким спектром пищевых продуктов.

13. Характеристика полной системы для анализа ГМО Определяет ГМО в соответствии с локальными и международными требованиями Структура и техническое оснащение полностью соответствуют этим требованиям Определяет все ГМО представленные на рынке Представляет количественную информацию Максимально надежная и воспроизводимая информация Работает с широким диапазоном с/х и пищевых продуктов Включает жесткую программу контроля качества

14. Критически проблемы при анализе ГМО Нулевая толерантность (качественный анализ) Предел обнаружения (LOD) Размер образца Специфичность к конкретному виду Пороги (количественный анализ) Пищевые образцы Контроль качества

15. Нулевая толерантность (качественный анализ)Предел обнаружения (0.01%)Размер образцаОпределение вида

16. Определение LOD для ГМО Пример: Кукуруза GA2110 разпроходила неопределенной через контролирующие лаборатории!!

17. Тестирование должно быть интегрировано с отбором проб, а лаборатория должна использовать статистически достоверные объемы образцов

18. Пример отбора образца Вся мощь ПЦР не может быть раскрыта с малыми объемами образцов. Смесь содержит 0.1% ГМО (1/1000) Размер образца = 1000 частиц 37% вероятность пропустить ГМО— ложно-негативный!! Размер образца = 10,000 частиц 99.99% вероятность что ГМО будет обнаружен.

19. Образец должен быть репрезентативным Партия продукта Лабораторный образец 3 кг семян (зерна) Аналитический образец 2 г на дуплекс

20. Большой гомогенизатор – залог успеха!

21. Нулевая толерантность создает проблему обнаружения ГМО.Промышленный стандарт «предела обнаружения» (LOD) для ГМО 0.01%

22. Общие элементы последовательностей 35S Промотор FMV Промотор NOS Промотор Промотор актина риса 35S Промотор NOS Промотор E9 Промотор PIN II Промотор Другие…

23. Пороги (количественный анализ):Риал Тайм ПЦР наиболее аккуратный и гибкий метод.

24. ПЦР аккуратно определяет % ГМО % ГМО определяется по соотношению генов: [Копии маркерного гена ГМО в образце] [Копии маркерного гена культуры в образце] Нужно использовать мультиплексную ПЦР с детекцией в реальном времени!!

25. Количественные методы связаны с погрешностью измерений. С целью определять ГМО ниже уровня установленного для содержания ГМО законодательством, необходимо работать существенно ниже порогового уровня.

26. Образцыпродуктов Метод экстракции Деградация ДНК

27. Система должна включать диапазон методов специфичных к исследуемым продуктам Пищевые продукты содержат ингибиторы ПЦР. Ингибиторы должны быть удалены перед ПЦР. Химический состав разных продуктов и культур сильно отличается. Поэтому методы выделения ДНК должны подбираться индивидуально. Готовые наборы как правило не адекватны.

28. Наиболее оптимальным методом выделения ДНК является использование магнитных частиц Преимущества: • Высокая специфичность – ДНК селективно отбирается • на магнитные частицы • Очень высокий выход ДНК – связывается вся ДНК • Наилучшая очистка и удаление ингибиторов ПЦР – вымывается всё кроме ДНК • Возможность автоматизации - использование разных протоколов • выделения с автоматической системой • Высочайшая воспроизводимость и надежность – роботизированные системы исключают ошибку оператора

29. Методы экстракции должны удалять ингибиторы находящиеся в сложных пищевых образцах. В сильно обработанных пищевых образцах происходит деградация ДНК, что влияет на общую чувствительность. Поэтому необходимо дополнительно подтверждать результаты с использованием положительных контролей.

30. Контролькачества Контроли ПЦР Внутренние контрольные образцы Тест профессионализма

31. Все методы анализа должны включать адекватные контроли ПЦР ингибиторы – внутренний контроль. Деградация ДНК – положительный контроль и внутренний контроль Постоянный уровень качества— количественные внешние стандарты Ошибки оператора и инструмента Дуплекс анализ, Множественные ГМО тесты, Доступ ко всем данным Целостный анализ данных Стандартный протокол для анализа данных Программы обучения

32. Выводы Анализ ПЦР возможен если присутствует 0.001% ГМО Промышленный стандарт для LOD - 0.01% ГМО Чувствительность ПЦР эффективнапри анализе семян если используется по меньшей мере 3 кг чтобы определить 0.01% Определение пороговых концентраций требует использования Риал Тайм ПЦР Для законодательно регулируемого порога 0.9%, рекомендуется определять уровень содержания 0.7% Сильно обработанные продукты нуждаются в дополнительном контроле качества анализа

33. Логическая схема анализа ГМО Зона 1 Забор образца Упаковка в соответствующую тару Внесение данных об образце в базу Сохранение архивного образца Гомогенизация образца Отбор аналитического образца в дуплексе Выделение и очистка ДНК Зона 2 Определение количества и чистоты ДНК Расчет эксперимента согласно ТЗ Зона 3 Подготовка реагентов и праймеров (премикс) Подготовка (разведение) ДНК и контролей Зона 4 Смешивание компонентов для ПЦР и запуск Риал Тайм ПЦР ПЦР с анализом по конечной точке Получение графика амплификации Анализ данных Зона 5 Данные приемлемые? Да/Нет Электрофорез Ввод данных в базу Создание отчета

34. Нормативная база ДЕРЖАВНІ САНІТАРНІ НОРМИ І ПРАВИЛА "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти I-IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами" Наказ МОЗ №26. 24.01.08 Порядок етикетування харчових продуктів, які містять генетично модифіковані організми або вироблені з їх використанням та вводяться в обіг Постанова КМУ №468 13.05.09

35. На диске вы также найдете: Предложение компании «Батик Био Трейд» по комплектации лаборатории для анализа ГМО Список необходимого оборудования с ценами Каталог оборудования для ПЦР лаборатории • Описание наборов для Риал-Тайм ПЦР и праймеров для анализа • на наличие и концентрацию следующих ГМ культур: • Соя • Рапс • Кукуруза • Сахарная свекла • Картофель Описание референсных материалов IRMM для анализа ГМО в пищевых продуктах

36. Спасибо за внимание!