Download
1 / 40
400 likes | 569 Views
PCR в реално време - в търсене на вируси, мечки, генно модифицирани храни и гени. Олга Белчева и Гюлназ Джебир 12.06.2012 Център по молекулна медицина. За какво ще говорим днес. Целта на заниманията ни днес е да разберем: що е то PCR в реално време;
E N D
PCR в реално време - в търсене на вируси, мечки, генно модифицирани храни и гени Олга Белчева и Гюлназ Джебир 12.06.2012 Център по молекулна медицина
За какво ще говорим днес • Целта на заниманията ни днес е да разберем: • що е то PCR в реално време; • какви са предимствата му пред „традиционния” PCR; • какви методи се използват за провеждането му; • за какво може да ни послужи.
PCR • Въз основа на данните получени от различните проекти за секвениране на човешкия геном е пресметнато, че всяка наша клетка съдържа около 3 млрд. б.д. ДНК или 10-25 000 белтък кодиращи гена. В повечето случаи ние се интересуваме от конкретни полиморфни варианти, екзони, регулаторни участъци или гени, а не от целия геном – работата ни е да открием игла в купа сено. • Полимеразната верижна реакция, PCR, ни позволява да намножим точно този участък, който ни интересува. Целта на PCR и PCR в реално време е една и съща – да получим смес от ДНК молекули, в която концентрацията на интересуващата ни нуклеотидна последователност е многократно по-голяма от тази на всички останали секвенции.
3 1 2 PCR – ход на реакцията
Какво става с нашата секвенция? • Теоретично, броят на новите копия нараства в геометрична прогресия. • На практика след определен етап нарастването се забавя, поради изчерпване на реактивите, паралелно разграждане на вече синтезирани фрагменти, „изтощаване” на ензима, и т.н.
Какво става с нашата секвенция? Така, ако искаме да преценим с колко копия сме започнали е най-добре да засечем продукта преди реакцията да се е забавила, т.е. преди графиката на зависимостта на броя копия от броя цикли да е достигнала плато. В този случай се интересуваме от т.нар. експоненциална част на графиката.
Малко математика • Разликата в броя ДНК молекули в началото на реакцията и към края й е огромно, което прави част от графиката „невидима”. За това, вместо да отчитаме какъв е броят на копията в края на всеки цикъл, можем да пресметнем степента на нарастването като използваме логаритмична функция. • 22=4 • log24=2
За различен брой копия от матрицата...
Малко математика • 102=100 • log10100=2 • lg100=2
Малко математика • Ако използваме десетичен логаритъм, скалата на ординатата ще намалее още по-вече – графиката се “снижава”.
PCR срещу Real-time PCR • Разликата между PCR и PCR в реално време е в това какво получаваме накрая. • PCR ни дава това: • PCR в реално време това:
PCR Real-time PCR PCR срещу Real-time PCR • Двата метода ни позволяват да отчетем резултатите в различен етап от амплификацията. • PCR ни дава възможност да видим продукта на последния цикъл – момента когато реакцията е достигнала плато. • PCR в реално време ни позволява да видим как се увеличава броя на копията на нашия продукт през цялото време на реакцията. По този начин можем да отчетем реалните разлики в началните количества на матрицата в различните проби.
TaqMan проби за Real-time PCR • Визуализацията на продуктите от първия цикъл на реакцията, когато те са малко на брой, може да се постигне чрез флуоресцентно белязване. Една възможност е използването на TaqMan проби. • Това са олигонуклеотиди, комплементарни на участък между двата праймера. В 5’ краяму е разположен флуорофор, а в 3’ края т. нар. затихвател (quencher). Когато върху пробата попадне лазерен лъч, високо енергийния флуорофор поема фотона, но ниско енергийния затихвател подтиска светенето му. В хода на амплификацията полимеразата започва да добавя нуклеотиди към 3’ края на праймера, а когато наближи пробата я разгражда (5’>3’ екзонуклеазна активност). Разпадането на пробата раздалечава флуорофора от затихвателя, в резултат на което той започва да свети.
TaqMan проби за Real-time PCR • В реакцията присъстват: • ДНК матрица; • праймери за интересуващата ни секвенция; • флуоресцентно белязана проба; • Taq полимераза.
Приложение на TaqMan пробите • Съществуват две основни приложения на флуоресцентно белязаните TaqMan проби за PCR в реално време: • количествен анализ – определяне на брой копия от дадена секвенция; • алелна дискриминация – разграничаване на два (или повече) варианта на една и съща секвенция. • За нуждите на количественият анализ използваме факта, че TaqMan пробите ни позволяват да отчетем броя на ново синтезираните фрагменти през експоненциалната фаза на амплификацията. • Когато трябва да различим алели, използваме проби, които са комплементарни на съответните варианти и са белязани с различни фолуорофора.
Количествен анализ с TaqMan • Техниката PCR в реално време най-често се използва за определяне на количеството (брой копия) на дадена секвенция. Нарастването на флуоресценцията с всеки изминал цикъл от експоненциалната фаза е право пропорционално на увеличението на броя копия на продукта. • Съществуват два варианта на количествен анализ: • абсолютен – измерва се точния брой копия от дадена нуклеотидна последователност; • относителен – определя се колко пъти повече/по-малко е дадена последователност в сравнение с референтна такава.
Абсолютен количествен анализ • Точното определяне на количеството на интересуваща ни секвенция става с помощта на стандартна крива, за построяването на която се използват серийни разредки на проба, съдържаща предварително известни количества от същата последователност. • В хода на PCR реакцията се отчита флуоресценцията на всяка от разредките и се построява графика на зависимостта на светенето от концентрацията им. Така построената графика се използва за да се определи на каква концентрация съответства измерената в неизвестната проба флуоресценция.
Построяване на стандартна крива флуоресценция на неизвестна проба
Относителен количествен анализ • Друг начин за извършване на количествен анализ е чрез нормализиране на пробите с помощта на вътрешна контрола. Такъв тип експериментална постановка се използва например за сравняване на нивата на транскрипция на един ген в различни типове клетки. Вътрешната контрола най-често е b-актин или глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа, за които се знае, че се експресират еднакво във всички клетки. • За всяка проба се използват два различно белязани TaqMan олигонуклеотида, съответно за изследвания ген и за контролата. Стойностите на флуоресценцията получени за контролата се използват за да се нормализират резултатите получени за интересуващия ни ген. В крайна сметка се получава сравнителна стойност, напр. колко пъти експресията на гена в клетки тип А надвишава тази в клетки тип Б.
Алелна дискриминация с TaqMan • С помощта на PCR в реално време, използвайки TaqMan проби, можем да докажем присъствието на полиморфни варианти в дадена секвенция. Пример за това е SNP генотипирането, което има за цел да определи дали в дадена проба присъстват две копия на алел 1, две копия на алел 2 или по едно копие от двата. • След края на тези безкрайно дълги обяснения ще имате възможност да изпробвате това на практика!
Алелна дискриминация с TaqMan • Резултатът е представен графично като може да видим едновременно генотипите на всички анализирани проби:
хетерозигот хомозигот • или за всяка проба по отделно:
TaqMan пробите не са единственият начин за проследяване хода на PCR реакции. Различни фирми са разработили различни техники за визуализация на резултатите от PCR в реално време (напр. Scorpions, Molecular beacon). Една много често използвана алтернатива е багрилото SYBR Green. Молекулите на багрилото интеркалират с ДНК – когато се закачат за малката бразда на двойно верижните спирали те започват да флуоресцират. SYBR Green или TaqMan
SYBR Green или TaqMan • Какви са предимствата и недостатъците на SYBR Green? • Предимства: • универсален маркер - не изисква специфични проби; • по-евтино – един и същи реактив може да се използва за различни PCR реакции; • по-висока чувствителност - много флуорофорни молекули се закачват към продукта. • Недостатъци: • провеждането на алелна дискриминация изисква допълнителна оптимизация; • риск от фалшиво-положителен резултат (може да бележи и неспецифични продукти).
Приложение • За какво бихме могли да използваме PCR в реално време? Най-често срещани са следните приложения на този метод: • идентификация на индивиди; • еволюционни проучвания; • количествен анализ; • търсене на патогенни мутации; • търсене на нови гени или генетични елементи свързани със заболявания при човека; • ...
