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实验五 核酸的定量

实验五 核酸的定量. — 定磷法测定 RNA 生命科学学院 沈剑敏. 实验目的. 学习和掌握定磷法测定核糖核酸 和脱氧核糖核酸的原理和方法. 核酸定量测定的几种方法. RNA DNA. 27%H 2 SO 4. 磷酸 + 戊糖 + 碱基. 核糖. 脱氧核糖. +. +. +. 利用紫外吸收法测定. 钼酸. 地衣酚 试剂. 二苯胺试剂. Vit C. Vit ·. 鲜绿色化合物. 兰色化合物. 磷钼蓝. 通过可见光比色测定核酸的含量.

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实验五 核酸的定量

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Presentation Transcript

  1. 实验五 核酸的定量 — 定磷法测定RNA 生命科学学院 沈剑敏

  2. 实验目的 学习和掌握定磷法测定核糖核酸 和脱氧核糖核酸的原理和方法

  3. 核酸定量测定的几种方法 RNA DNA 27%H2SO4 磷酸 + 戊糖 + 碱基 核糖 脱氧核糖 + + + 利用紫外吸收法测定 钼酸 地衣酚 试剂 二苯胺试剂 Vit C Vit· 鲜绿色化合物 兰色化合物 磷钼蓝 通过可见光比色测定核酸的含量

  4. 定磷法的原理 • 利用27%硫酸将核酸回流消化，使其从有机磷氧化成无机磷 • 无机磷与临时混合的定磷试剂中产生的钼酸反应生成磷钼酸铵黄色沉淀（这一步现象是观察不到的） • 再在一定酸度下遇还原剂（Vit C），其中的高价钼Mo6+被还原成Mo4+ • 此四价钼再与试剂中的其它MoO2－（钼酸根）结合成磷钼蓝 • 在一定的浓度范围内，蓝色的深浅与磷含量成正比，在660nm处有最大吸收峰

  5. 反应方程式 (NH4)2MoO4 +H2SO4 H2MoO4 +(NH4)2SO4 H3PO4 +12H2MoO4 H3P(Mo3O10 ) 4+12H2O H3P(Mo3O10 ) 4 Mo2O3·MoO3 Vit ·C 钼 蓝

  6. 主要试剂和器材 1.标准磷溶液:将磷酸二氢钾(KH2PO4，AR)预先置于105℃烘箱烘至恒重，降至室温后精确称取0.2195g(含磷50mg)，用重蒸水溶解，定容至50mL(含磷量为1mg/mL)为原液，冰箱贮存。测定时稀释100倍(含磷量为10μg/mL)。 2. 定磷试剂：3mol/L硫酸：水：2.5%钼酸铵：10% Vit ·C = 1：2：1：1（容积比）。 3. 电子天平；722型分光光度计和比色皿；恒温水浴；凯氏烧瓶。

  7. 操作方法 一、定磷标准曲线的制作： 以各管的磷含量(μg)为横坐标,660nm处的光密度值为纵坐标,绘制定磷标准曲线

  8. 二、磷样品的制备 1. 总磷样品的制备: 0.1g 酵母RNA + 3 mL 27% H2SO4 定容至1500mL 2. 无机磷样品的制备: 0.1g 酵母RNA 用少量蒸馏水溶解 定容至1500mL, 过滤 3. 总磷空白: 0.1mL H2O + 3 mL 27% H2SO4 定容至1500mL 一粒玻璃珠,H2O2 消化8小时至无色透明 一粒玻璃珠,H2O2 消化8小时至无色透明

  9. 三、磷含量的测定

  10. 核酸含量的计算 • 有机磷O.D. 660 = M(总磷O.D. 660 ) －M(无机磷O.D. 660 ) 由标准曲线查得有机磷微克数（x μg） • 计算出核酸制品中核酸的百分含量 核酸 % = ×100% x × 稀释倍数 × 11 测定时取样毫升数 RNA样品重量（ μg ）

  11. 思考题 为什么所用水的质量、钼酸铵的质量和 显色时酸的浓度对测定结果影响较大？

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