分子生物学实验

1. 分子生物学实验

2. 目 录 实验一、植物染色体DNA的提取及纯度鉴定 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取 实验三、琼脂糖凝胶电泳 实验四、ＤＮＡ的限制性酶切 实验五、大肠杆菌感受态细胞的制备及外源DNA的转化 实验六、PCR基因扩增技术

3. 实验一、植物染色体DNA的提取 及纯度鉴定

4. 一、实验目的 • 掌握真核植物基因组染色体DNA的一种提取方法 • 学习使用紫外分光光度法鉴定DNA的纯度，估计相对含量。

5. 二、实验原理 • 用低温机械研磨和高浓度、SDS等破坏细胞壁及膜，使蛋白变性使DNA与蛋白分离，用一定浓度的溶液将DNA提取出来，用高浓度乙醇沉淀DNA，氯仿/异戊醇等去除杂质，RN ase降解核酸，得到纯度较高的DNA样品。根据核酸与蛋白质分别在OD260和OD280有吸收峰分别测定之，比较OD260/OD280比值在1.8附近程度估计纯度，依据经验公式计算DNA含量。

6. 三、实验材料与试剂物品 • 1.材料 • 香椿（Toona sinensis）黄花苗

7. 2、试剂 • 提取缓冲液（预冷） • SSC • RNase液

8. 3、仪器设备 • 高速冷冻离心机（8-316） • 制冰机（8-312） • 紫外可见分光计（8-316） • 冰箱（-86度在8-312，-20度，4度在8-312） • 水浴锅 • 电子天平 • 玻璃仪器等

9. 四、实验操作流程 • 采摘芽苗，洗净→剪小段，擦干表面水分→放-86度冰箱冻30分钟以上→冰浴研磨匀浆（分次加提取液）→以下见讲义

10. 五、结果与处理 • 纯度 • 含量

11. 思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？思考题：影响本实验结果的因素有哪些，要得到高纯度的DNA需要在实验中注意哪些问题？

12. 实验二、大肠杆菌质粒DNA的提取

13. 目的与要求 • 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA的方法，了解用分光光度计测定DNA含量的方法。

14. 2. 相关知识及原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

17. DNA超螺旋结构

18. 常用的质粒载体 • 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700

19. 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。

20. 质粒类型： • 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； • 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

21. 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 • 具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。

22. EcoRI Insert 1.9kb XhoI

23. 载体的结构： • 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) • 启始复制子（ori, Origin of replication)； • 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； • 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。

24. Ampr抗性基因 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力

25. 二、实验原理 • 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 • 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。

26. DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。

27. SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

28. 细菌裂解的方法： • 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。

29. 提纯的思路 • 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA • 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 RNA

30. DNA浓度的测定： 测定DNA浓度的方法主要有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；第二种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。另外还有一种用于粗略检测DNA浓度的方法是通过凝胶电泳，与标准分子量相比较。

31. 紫外光吸收法： 因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。

32. 3.材料与试剂 材料:含有质粒大肠杆菌JM83+。

33. 三、实验仪器、材料与试剂 （一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅 （二）材料：含有质粒的大肠杆菌JM83+、LB液体培养基 （三）试剂： • 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 • 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 • 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋　　　　　　　可中和DNA

34. 溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA， 25mMTris-HCl pH8.0。 溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液或水（+ 20g/ml RNase ）: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇

35. 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 • 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 • TE缓冲液：溶解DNA

36. 　四、实验步骤 接含质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中  370C，190rpm振荡培养过夜  取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 6000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体  100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）10min  加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置5min裂解菌体

37.  加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置15min质粒DNA复性  12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管  上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀）  12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管  （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀）  12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管  上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），冰浴 30min 

38. 12000rpm，离心15min  沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心）  12000rpm，离心10min  沉淀超净台中风干  沉淀用20uL RTE溶解，-200C保存

39. 注意： • 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！

40. 质粒小量提取的方法（手工提取）： • 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; • 取液体培养液1.5-2ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; • 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;

41. 加入150  l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; • 用冷冻高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; • 沉淀用0.5ml 70％乙醇清洗一次， 12000r/min离心5min，弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; • 加入30-50l含有20g/ml RNase的灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); • 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。

42. B. 用分光光度计法定量DNA • 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释); • 蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。

43. 加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。

44. 记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: • dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 • 以上浓度单位为g /ml

45. 实验三、琼脂糖凝胶电泳

46. 一、实验目的 • 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

47. 二、实验原理 • DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 • 核酸为两性分子，在PH3.5时，整个分子带正电； PH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 • 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 • 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。

48. 三、仪器、材料与试剂 • （一） 仪器　 • （二）材料　 1.自已提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品 （三）试剂　 1．5× TBE储液(PH8.0)　使用时稀释 10倍成0.5×TBE （1×TBE也可）。 2．凝胶加样缓冲液　0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖 4.10mg/ml溴化乙锭溶液（EB），4℃保存。用时稀释成5ug/ml的EB。

49. 四、实验操作步骤 • 琼脂糖凝胶的制备（配制浓度依照所提质粒的大小来确定）. • 凝胶板的制备 • 加样（加样体积在10~30ul） • 电泳 • 染色 • 结果观察

50. C. 凝胶电泳检测DNA的浓度 • 0.8%的琼脂糖凝胶，100V,40分钟。 • NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)