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Chapter 11. Studying gene expression and function

Chapter 11. Studying gene expression and function. • 유전자 발현의 기본원리. • 전자현미경을 이용한 핵산 분자의 분석 ‑ 핵산 분자의 지름을 증가 ; 화학물질 처리 ‑ Cytochrome C ; polynucleotide 에 결합 ‑ Electro-dense ; Acetate 처리 ‑ 염색 ‑ 핵산 관찰. • 유전자의 전사체에 대한 연구 1. 전자 현미경상으로 관찰시 나타나는 DNA-RNA 혼성체 ‑ Intron 의 수 와 위치를 결정.

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Chapter 11. Studying gene expression and function

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Presentation Transcript

  1. Chapter 11. Studying gene expression and function

  2. •유전자 발현의 기본원리

  3. •전자현미경을 이용한 핵산 분자의 분석 ‑ 핵산 분자의 지름을 증가 ; 화학물질 처리 ‑ Cytochrome C ; polynucleotide에 결합 ‑ Electro-dense ; Acetate 처리 ‑ 염색 ‑ 핵산 관찰

  4. •유전자의 전사체에 대한 연구 1. 전자 현미경상으로 관찰시 나타나는 DNA-RNA 혼성체 ‑ Intron의 수 와 위치를 결정

  5. 2. 핵산분해효소의 처리를 통한 DNA-RNA 융합체 분석 ‑ S1 nuclease ; 단일 가닥 사슬의 핵산에만 반응하는 핵산 분해효소 ‑ Alkali 처리 ; RNA 분해

  6. 3. Primer extension ‑ RNA의 5’말단을 확인 ‑ Primer ; 염기서열 일부분을 알아야 함 ‑ Reverse transcriptase

  7. • RNA 전사체 연구를 위한 기타 방법들 1. Northern hybridization ‑ Formaldehyde gel ; ‑ 변성화 ‑ 분자간 또는 분자내에서 ‑ 염기쌍을 이루는 것을 막아줌 ‑ 포유류의 ribosomal RNA ; 4718bp & 1874bp

  8. 2. 역전사 PCR (RT-PCR) ‑ Reverse transcriptase ‑ Taq. Polymerase ‑ 유전자의 발현 양상 조사 ‑ RACE ; ‑ Rapid amplification of cDNA ends ‑ RNA 분자의 5’과 3’말단을 확인

  9. •유전자 발현의 조절에 관한 연구 ‑ 조절 단백질 (조절 부위)

  10. • DNA 분자상의 단백질 결합부위 결정 1. DNA-protein 복합체의 gel retardation ‑ 분자량이 증가 ; 낮은 이동성 ‑ 조절부위 ; 10bp 미만

  11. • Gel retardation experiment

  12. 2. Footprinting with DNase I ‑ 조절 단백질이 DNA 상에 결합함으로써 조절부위가 Dnase I과 같은 Endonuclease에 의해 분해되지 않는다는 원리

  13. • DNase I footprinting ‑ 각 DNA 단편 한 쪽 말단에 방사성 동위원소로 표지 ‑ 조절 단백질 첨가 ‑ DNA 조각이 완전히 분해되지 않을 정도의 DNase I 첨가 ‑ Phosphodiester bond을 절단

  14. 3. Modification interference assays ‑ 조절 단백질은 조절 염기서열 보다 더 길게 DNA를 결합하고 있음.

  15. • Modification interference assay ‑ End-labelling ‑ Dimethyl sulphate ; Methyl groups to guanine NT ‑ Piperidine ; 메틸화된 NT의 DNA 분자를 절단

  16. • Deletion analysis를 이용한 조절부위의 동정

  17. • Reporter gene ‑ 숙주세포에서 발현되지 않는 표현형 ‑ 검정하기가 용이 ‑ 정량적으로 분석 가능

  18. • Deletion analysis ‑ 유전자 발현 양상 ‑ 조직 특이성 변화 ‑ 발생과 분화에 대한 유전학적 분석

  19. • HRT ; Hybrid-release translation • HART ; Hybrid-arrest translation ‑ 유전자에 의해 합성되는 단백질을 동정 ‑ 씨앗 또는 토끼의 reticulocyte 추출물 ‑ 35S-methionine + 19 amino acid

  20. • HRT ; Hybrid-release translation ‑ Specific cDNA ‑ 변성 ‑ Nitrocellulose or nylon membrane ‑ mRNA sample ‑ Hybridized mRNA ‑ Translation

  21. • Hybrid-arrest translation ‑ mRNA + single strand cDNA ‑ Translation

  22. • Analysis of proteins by in vitro mutagenesis

  23. •돌연변이 기법 1. 제한효소 단편에서의 결실 2. 제한효소 인식부위에서의 NT 제거 ; ‑ Endonuclease, Bal31 3. Oligonucleotide 삽입 ; ‑ 불안정화 ‑ -helix (새로운 구조)

  24. • Oligonucleotide-directed mutagenesis (point mutation) ‑ Single-stranded DNA ; M13 vector ‑ Double-stranded DNA ; ‑ Short primer (oligonucleotide) ‑ Klenow fragment ‑ dNTPs ‑ Transfection into E. coli ‑ Semi-conservative nature of DNA replication

  25. •단백질과 단백질의 상호작용에 관한 연구 1. Phage display ‑ Phage display library ‑ Microtitre well or Chromatography column

  26. •단백질과 단백질의 상호작용에 관한 연구 2. Yeast two-hybrid system ‑ Bait vector ‑ Prey vector (library)

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