補足：分子量の求め方

1. 補足：分子量の求め方 二次元電気泳動の基本

2. SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？SDS－PAGEの泳動像から分子量を推定するには？ タンパク質のバンドの移動距離を、分子量が既知のタンパク質の ものと比較することで、目的のタンパク質の分子量を算出できる 同じゲルの中で既知のタンパク質（分子量マーカー）を泳動する 分子量マーカーのバンドの移動距離を測り、分子量と対応する 移動距離を片対グラフにプロットする これを検量線として目的のバンドの移動距離から分子量を求める

3. SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質SDS-PAGEの分子量マーカーに使用される代表的なタンパク質

4. サンプル 分子量マーカー 分子量算出の手順～バンドが綺麗に揃ったゲルの場合～ １）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる 3.6 6.7 12 .7 23.6 33.5 44.6mm

5. ２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量　　をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする２）片対グラフの横軸（普通目盛）に移動距離、縦軸（対数目盛）に分子量　　をとり、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする ３）移動度－分子量標準曲線を求める

6. サンプル 分子量マーカー 28.5mm ４）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる ５）その数値を３）で求めた標準曲線の式（y＝267249ｘ－0.7341）に代入し 　 分子量を算出する 267249×28.5 －0.7341＝22851.49 求めるタンパクの分子量

7. サンプル 分子量マーカー 分子量算出の手順～スマイリングしたゲルや別のゲルで比較する場合～ １）分子量マーカーの各バンドの位置を明確にし、分離ゲルの上端からの 移動距離を正確にはかる ２）レーンの同じ場所で泳動のフロントラインの移動距離を正確にはかる BPB

8. サンプル 分子量マーカー 0.25 0.67 1.0 ３）フロントラインの移動距離を１として、それぞれの分子量マーカーのバン　　ドの移動距離の相対値（＝相対移動度：Rf値）を計算する

9. ４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量を４）片対グラフの横軸（普通目盛）にＲｆ値、縦軸（対数目盛）に分子量を とり 、分子量マーカーの各バンドの値をプロットする ５）Rf値－分子量標準曲線を求める

10. ７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる７）目的のバンドの位置を明確にし、移動距離を正確にはかる ８）そのサンプルが流れているレーンの同じ場所で、泳動のフロントライン　 　 の移動距離をはかる ９）フロントラインの移動距離を１として、目的のタンパク質のＲｆ値を計算し 　 ５）で求めた標準曲線の式（y=15154x－0. 7425）に代入すると、分子量が 　 算出できる サンプル 分子量マーカー 0.57 1.0 15154×0.57 －0.7425＝22771.73 求めるタンパクの分子量

11. 二次元電気泳動での分子量マーカーの使い方 分子量マーカー のバンド

12. S-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れるS-S結合の切断により約50kDaのバンドと約22kDaのバンドがそれぞれ現れる SDS-PAGEで分子量を測定する上での注意点 ・塩基性に富んだタンパク質はSDSの結合量が少なくなるため、移動度が 小さくなる＝見かけの分子量が大きくなる ・タンパク分子内に疎水性に富んだ部分が多い場合は、SDSの結合量も 　多くなり、移動度が大きくなる＝見かけの分子量が小さくなる ・糖タンパク質や酸性タンパク質はSDSの結合量が少なく、移動度も小さい 　＝見かけの分子量が大きくなる ・多量体やサブユニット構造をとっているタンパク質分子では、SDS-PAGEで わかるのはその単一ポリペプチドの分子量だけで、その分子が生体内で 機能している状態の分子量はわからない 例）　　免疫グロブリン＝重鎖2本と軽鎖2本がS-S結合した構造をもつ

13. L鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれているL鎖とH鎖、H鎖とH鎖同士はS-S結合で結ばれている 免疫グロブリンの構造 2本のL鎖と2本のH鎖で 構成されている 黄色い部分＝Light chain 　　　　　　　　　　　　　（L鎖） 緑色の部分＝Heavy chain 　　 　　　　　　　　　　（H鎖）