養殖石斑魚 ( Epinephelus spp.) 虹彩樣病毒 (iridovirus-like) 感染症

1. 中華獸醫誌 J Chin Soc Vet Sci 23(5)：411-422, 1997 養殖石斑魚(Epinephelus spp.)虹彩樣病毒(iridovirus-like)感染症 趙嘉本, 龐飛 指導教授：古鎮鈞 學生：王茂麟 學號：1092407027

2. 圖文摘自：台灣魚類資料庫 石班魚分類 • 脊索動物亞門　Subphylum Vertebrata條鰭魚綱　Actinopterygii　新鰭亞綱　Neopterygii　　鱸形目　Perciformes　　　鱸亞目　Percoidei　　 　　鮨科　Serranidae　　　　石斑魚屬　Epinephelus　　　　 　鱸滑石斑魚　Epinephelus tauvina

3. 前言 • 石斑魚(Epinephelus spp.)為本省重要養殖魚種之一。而放養魚苗常因本地產量不足，而需自東南亞國家進口。 • 1983年，於美國Boston地區發生養殖之goldfish (Carassius auratus L)被iridovirus所感染 (Berry et al., 1983)。

4. 虹彩樣病毒(iridovirus-like)感染症，會引起澳洲的河鱸(Perca fluviatilis)造血組織壞死及大量死亡，故本病又稱之為流行性造血組織壞死症(epizootic haematopoietic necrosis；EHN) (Langdon et al., 1986 ; 1987)。

5. 1986年，養殖的虹鱒(Salmogairdneri Richardson)亦發生類似的病原感染 (Langdon et al., 1988) 。 • 1991年，於日本Shikoku地區養殖之嘉鱲(Pagrus major)，因感染一種型態上屬於Iridoviridae的病毒，造成魚隻嚴重貧血，並引起20-60%之死亡率 (Kiyoshi et al., 1992)。

6. 1994年，新加坡近海箱網養殖之石斑魚(Epinephelus tauvina)，亦因感染一種可能為Iridoviridae的病毒性疾病引起大量魚苗與成魚的死亡；同時間馬來西亞亦發生類似疫情 (Chua et al., 1994)。

7. 本省自1993年起，由東南亞進口之金目鱸(Latus calcarifer)魚苗以及成魚，均分別感染虹彩樣病毒(iridovirus-like)，而該病毒型態特徵以及魚體病變與澳洲鱸科魚類所感染之病毒時很相似 (Langdon et al., 1987；1988) 。 • 本次石斑魚所感染之病原，推測可能與上述地區，特別是日本及新加坡，所發生之病毒感染症有密切關係。

8. 圖文摘自：台灣魚類資料庫 金目鱸分類 • 脊索動物亞門　Subphylum Vertebrata　條鰭魚綱　Actinopterygii　新鰭亞綱　Neopterygii　　鱸形目　Perciformes　　　鱸亞目　Percoidei　　　　尖嘴鱸科　Latidae　　　　 尖吻鱸屬　Lates　　　　　尖吻鱸　Lates calcarifer

9. 材料與方法 • 疫情 • 病魚解剖、寄生蟲檢查 • 細菌分離 • 組織病理檢查 (光學顯微鏡、電子顯微鏡) • 感染試驗(同居感染、動物接種、水質監測)

10. 疫情 針對本流行病進行各魚苗繁殖場、成魚養成場的 發生率、致死率之調查。 進行追蹤調查有無再發生的情形。

11. 病魚解剖、寄生蟲檢查 解剖同時，對體表、鰓、消化道進行壓片。 檢查有無寄生蟲寄生。

12. 細菌分離 以無菌操作方式，取下脾、肝、心、腎、 腦等臟器。 培養於brain heart infusion agar(BHIA)+CO2、 blood agar plate(BAP)+CO2 等培養基行初代分離。 上述培養基均購自Difco laboratories, Detroit, USA。

13. 組織病理檢查(光學顯微鏡) 將病魚各臟器以 10% 中性福馬林固定24小時。 酒精系列脫水。 石蠟包埋。 以Hematoxylin & eosin (H&E) 及periodic acid Schiff (PAS) 染色。 阿拉伯膠封片後以光學顯微鏡進行鏡檢。

14. H&E (hematoxylin & eosin) 染色 • 蘇木紫 & 伊紅染色，常用於組織切片；hematoxylin 可將細胞核、軟骨等嗜鹼性組織染色， eosin則可將細胞質、紅血球、纖維素等嗜酸性組織染色。 • 紅血球對eosin的吸收性極佳，可輕易染上鮮明之紅色。

15. PAS (periodic acid Schiff) 染色 • 過碘酸染色；在蛋白質上的糖分子，會因過碘酸氧化而產生醛基，其與 Schiff’s reagent 結合會產生紫紅色堆積物。 • 可將多醣類染成紫紅色；在病理組織學上用於檢測細胞內的異生物，多醣體變性等。

16. 另參考Hsiung (1994) 之方法，將病魚脾臟抹片 以 Carnoy’s 固定液固定。 以acridine orange 及Feulgen 染色。 分別以螢光顯微鏡與光學顯微鏡進行鏡檢。 上述三種配置試藥均來自E merck, Darmstadt, Germany。

17. Carnoy’s 固定液 • 為甲醇：冰醋酸體積比 3：1 調配而成；使用需臨時配製，長時間放置會影響固定效果。 • 固定時間為 15分-24小時，於低溫、室溫均可使用。 • 必要時可改變二者比例。

18. AO (acridine orange) • 為螢光染劑，可染上活細胞；由於此染劑是染包核內的 chromatin，故正常的細胞核以及 apotosis 早期的胞核在螢光顯微鏡下會呈現綠色。

19. Feulgen 染色法 • 將 DNA 經 1N HCl 於 60。C 水解後，除去核酸中的嘌呤鹼，使去氧核醣中的醛基釋出，再將之移入 Schiff’s reagent 中，試劑即會與醛基反應呈紫紅色。 • 1942 年由 Feulgen 提出，為 DNA 之特異性檢測法。

20. 組織病理檢查(電子顯微鏡) 參考陳等 (1991) 及 Bozzola (1992)之方法，將 病材修成體積約 1 mm3之大小。 於4。C下以 2.5 % 之戊二醛固定 2 小時。 以緩衝液清洗。 以 1 % 鋨酸固定 1 小時。 以酒精系列脫水。

21. 以 spurr resin (EMS, USA) 包埋。 切成 70 nm 之切片。 以醋酸鈾醯 (uranyl acetate) (EMS, USA) 以及 檸檬酸鉛 (lead citrate) (EMS, USA) 雙重染色。 以 Hitachi H700 型穿透式電子顯微鏡於 75 kv 加速電壓下進行鏡檢。

22. 感染試驗(同居感染) 選擇發病池中體長 7-8 公分具病徵之石斑魚及 體長 5-7 公分健康石斑魚各 10 隻。 混養於體積 500 公升之養殖桶中。

23. 感染試驗(動物接種) 在 2 個容量 200 公升之水族箱中，各放入體長 6-8 公分之健康石斑魚 10 尾。 分別以肌肉和腹腔注射之方式，每尾各注射乳 劑 (以病魚之鰓、脾及前、後腎做成 10% 乳劑 並經0.45 μm 過濾膜過濾) 0.1 cc 後觀察。 另設有僅注射等量稀釋液的對照組。

24. 感染試驗(水質監測) 實驗期間所有水溫維持於 28-30。C之間。 pH 值以 Suntex PC 310 pH meter (Suntex)分析。 溶氧以 Winkler method 分析。 亞硝酸氮 (NO2-N) 以 Wood-Armstrong-Richard method 分析。 總氨 (NH3-N) 以indophenol method 分析。 鹽度以 Atoyo hand refractor (Atago) 分析。

25. 結果 • 疫情 • 病魚解剖、寄生蟲檢查 • 細菌分離 • 組織病理檢查 • 感染試驗

26. 疫情 • 於1994年6月起至1997年於高雄縣、台南縣及屏東縣等地區之石班魚繁養殖業，陸續發生魚隻斃死疫情，尤以永安鄉、彌陀鄉及林園鄉最為慘重。 • 本病具很強之水平感染能力，感染初期魚隻無異樣，每日僅數尾死亡，而後死亡率漸增，整個疫情約 1-2 個月。

27. 2-4 吋小魚感染率常達 100%，致死率在 60% 以上；體長超過25公分的成魚隻死亡率則在 5-30% 之間。 • 感染過之病魚無法獲得終身免疫，常會再發，但死亡率往往降至 5% 以下。

28. 病理解剖、寄生蟲檢查 • 病魚呈現體色變黑，偶見眼球混濁，鰓部於急性，亞急性時，常可見充、出血現象，而後鰓絲漸呈淡紅甚至蒼白。 • 脾臟和前腎明顯腫大約 2-10 倍 (圖1) ，後腎微腫，腹壁偶可見出血點。鰓部壓片可見病魚鰓絲血管結構凌亂 (圖2) 。

29. 於 121 個病例中，偶見鰓及體表有寄生蟲寄生，如車輪蟲、海水白點蟲、舌杯蟲或單殖類吸蟲等。

30. 細菌分離 • 有 17 場有分離出弧菌 (Vibrio spp.) 感染，尤其是以魚苗體表糜爛病灶區的分離率最高。

31. 組織病理檢查 • 於脾、前腎、後腎、心、肝及鰓部等臟器內，出現大量肥大但大小不一的細胞，以脾和前、後腎內含量最多。 • 該肥大細胞之核偏於一邊，細胞質或呈顆粒或呈均質樣，染色性則呈嗜酸性或嗜鹼性不等。

32. 細胞質呈嗜酸性者，不論是顆粒或均質樣，均對 PAS 染色呈陽性反應。 • 在 acridine orange 及 Feulgen 染色下，前者於這些肥大細胞的細胞質內呈現黃綠色螢光反應，後者則呈紅色螢光反應；此結果顯示在這些細胞質內含有雙股 DNA。

33. 某些嗜鹼性細胞的核內並出現染色質邊緣化及疑似嗜鹼性包涵體結構物的形成。某些嗜鹼性細胞的核內並出現染色質邊緣化及疑似嗜鹼性包涵體結構物的形成。 • 肝臟呈現全面性脂肪變性；許多肝細胞之細胞質內含有大小不一、數量不等的嗜伊紅性均質團塊物質。

34. 血管周圍有單核炎症細胞及類上皮細胞的圍管現象。血管周圍有單核炎症細胞及類上皮細胞的圍管現象。 • 鰓部二級鰓薄板的上皮細胞發生增生和剝離，偶可見柱細胞 (pillar cell) 的變性和壞死。

35. 且二級鰓薄板之微血管呈不等程度之擴張。而擴張的管腔內往往充塞許多肥大細胞 (圖3) 。 • 心肌內可見局部壞死和單核白血球浸潤。

36. 脾臟內亦有類上皮細胞的浸潤，淋巴及造血細胞則明顯減少，且有多發性大小不一的實質部壞死。脾臟內亦有類上皮細胞的浸潤，淋巴及造血細胞則明顯減少，且有多發性大小不一的實質部壞死。 • 疑似嗜鹼性之核內包涵體結構物主要出現於脾臟內的顆粒狀嗜鹼性肥大細胞 (圖4 及 圖5)。

37. 前腎及後腎間質亦有類似於脾臟的現象，且偶可發現絲球體上皮細胞的壞死。前腎及後腎間質亦有類似於脾臟的現象，且偶可發現絲球體上皮細胞的壞死。 • 電子顯微鏡下，可見鰓部二級薄板的微血管內出現大量肥大細胞 (圖6)，並於其細胞質內和血液中發現病毒顆粒 (圖7)；脾及前腎竇狀系中亦發現游離的病毒顆粒。

38. 在肥大細胞的細胞質內，常可見溶素體的存在，完整的病毒顆粒除常大量出現在其細胞質內 (圖8)，亦常於各種胞器內被發現 (圖9 及 圖10)。 • 受病毒感染的肥大細胞胞質內之粒腺體和內質網等胞器，常出現腫脹、破裂及形成碎片等病變 (圖11)。

39. 有些肥大細胞其胞質內可見類似病毒的合成區 (圖12)。 • 病毒顆粒大小約 120-130 nm (side-side) 到 160-170 nm (apex-apex)，具內、外膜，高電子密度之核衣約 60-110 nm，在膜與核衣間的電子低密度區約 20-50 nm。

40. 感染試驗 • 同居感染組放入的健康魚隻，自第 14 天起可明顯觀察到其呼吸頻率加快、鰓蓋動作加大及體色漸黑，而後陸續死亡，其致死率達 60%。 • 動物接種組不論以肌肉或腹腔注射，皆可於第 7 天起觀察到上述症狀，第 10 天起陸續死亡，致死率分別為 60% 及 70%。

41. 在感染試驗死亡之魚隻中皆可於各臟器內發現類似自然感染魚隻之病灶及病毒顆粒。在感染試驗死亡之魚隻中皆可於各臟器內發現類似自然感染魚隻之病灶及病毒顆粒。

42. 上述試驗水族箱中之水質皆維持於 pH 值 7.8-8.5、溶氧量 6-8 ppm、NO2-N 濃度 0.08 ppm 以下、 NH3-N 濃度 0.1 ppm 以下及鹽度 3.2%-3.5%。

43. 討論 • 由自然感染、人工接種及同居感染病魚的臨床症狀和病理學的檢查結果，可推判本病例為石斑魚病毒感染症。 • 病毒分類需以生化、核酸的分析資料為依據 (Willians et al., 1994)，本病例依電子顯微鏡下病毒型態的特徵及其染色呈雙股DNA 陽性反應的結果，而推判該病毒屬虹彩病毒科 (Iridoviridae) (Leibovitz et al., 1980 ; Wolf , 1962)。

44. 台灣養殖石斑魚過去並未有類似病例發生，而在 1997 年左右大量引進魚苗後，開始有本病發生，故推測本病原應與外地魚苗的引入有密切關係。

45. 本病好發於春、夏、秋季高溫期，此情形與澳洲等地魚隻感染虹彩病毒的情形相類似 (Kiyoshi et al., 1992 ; Langdon et al., 1986 ; 1987 ; 1988)。 • 本病的病毒可以感染多種石斑魚品種，但混養之吳郭魚、虱目魚、烏魚及草蝦則無感受性。

46. 發病病徵與發生於澎湖箱網養殖之黃錫鯛 (Rhabdosargus sarba) 相類似 (Ku et al., 2005)。 • 本病與發生於新加坡之嗜眠石斑魚病 (sleepy grouper disease) 及日本 Shikoku 嘉鱲 (Pagrus major) 之虹彩病毒感染症的病灶及病毒顆粒特徵皆極為相似 (Chua et al., 1994 ; Kiyoshi et al., 1992)。

48. 本病不同於另二種同樣由虹彩病毒引起的疾病；一為病毒性紅血球壞死症 (erythrocytic necrosis virus; ENV)，另一為淋巴囊腫病 (lymphocytic disease; LD) (Appy et al., 1976; Roberts, 1989; Smail et al., 1980; Smail et al., 1989)。

49. 故同為虹彩樣病毒感染，但在不同魚種間卻有明顯差異，推測可能是不同病毒基因或魚隻感受性不同所致，這些疑點仍有待進一步確認。故同為虹彩樣病毒感染，但在不同魚種間卻有明顯差異，推測可能是不同病毒基因或魚隻感受性不同所致，這些疑點仍有待進一步確認。

50. 病灶中出現的肥大細胞由於胞質內常含溶素體，偶見吞噬有紅血球，又 PAS 染色呈陽性，故推測可能為巨噬細胞。 • 由 TEM 檢查結果顯示某些肥大細胞胞質內充滿病毒顆粒，某些則僅見少許病毒顆粒，推測可能為另一類呈嗜酸性均質樣肥大細胞之前身。