OLITRACE2

1. OLITRACE2 Estudio de la trazabilidad sensorial de los aceites elaborados en el suroeste de la península Ibérica. Instituto de la Grasa- CSIC Diego L. García González Ramón Aparicio López María Teresa Morales Millán Instituto Politécnico de Beja Manuel Joaquín Marques Patanita Isabel Maria Pereira Caldas Baer Universidade do Algarve Ana Cristina Figueira Universidad de Huelva Rafael Beltrán Lucena Ana Sayago Gómez Valeria Gallo Mazzuchino María Beltrán Muníz Mariluz Pizarro Hierro Mercedes Becerra Herrera

2. INDICE • OBJETIVOS • TAREAS REALIZADAS • METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD • RESULTADOS • ESTUDIO ESTADÍSTICO • 5.1. Huelva y Distritos de Faro (Algarve) y Beja (Alentejo) • 5.2. Huelva y Distrito de Beja • 5.3. Huelva

3. 1. OBJETIVOS

4. 1. OBJETIVOS Relacionar la evolución de los compuestos fenólicos con el proceso de recolección de la aceituna y de extracción del aceite en almazaras seleccionadas. Sugerir posibles mejoras en el proceso integral de extracción del aceite de oliva virgen (“Good Manufacturing Process”). Interpretar la caracterización sensorial de los aceites, según panel de expertos de las almazaras, en función de la composición química de los aceites. Diseñar un modelo de operativo de funcionamiento para mantener una calidad sensorial distintiva de los aceites onubenses

5. Diagrama de flujo del plan de trabajo propuesto

6. Búsqueda Bibliográfica Puesta a punto de las técnicas analíticas necesarias para la determinación de fenoles. Determinación de compuestos fenólicos (HPLC) Estudio estadístico de los datos relacionados con la trazabilidad sensorial Intercambio de información entre los miembros del equipo de trabajo Difusión de los resultados 2. TAREAS REALIZADAS

7. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD Se utilizó un HPLC-DAD Agilent 1260. Se aplicó un gradiente de fase A (agua/metanol/ácido acético 93:5:2 v/v/v) y fase B (metanol/ácido acético 98:2 v/v) en fase reversa con una columna Nova-pack C18. El flujo utilizado fue de 1 mL/min y la temperatura se mantuvo a 20ºC.

8. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD Los compuestos fenólicos eluyen en función a su polaridad; así, los feniletilalcoholes eluyen los primeros, antes de los 45 minutos, mientras que los flavonoides eluyen tras los 60 minutos, cuando incrementa la concentración de metanol en la fase móvil. La identificación de los fenoles se realiza a tres longitudes de onda diferentes (280 nm, 320 nm y 360 nm). La cuantificación se logra utilizando curvas de calibración externa con cada uno de los patrones de fenoles. Todos los análisis se realizan por triplicado y los resultados se expresan como la media de los valores obtenidos.

9. mAU mAU mAU 800 1200 1000 a) b) c) 1000 600 800 800 600 400 600 400 200 400 200 200 0 0 0 d) e) f) mAU mAU 30 20 25 15 20 10 15 5 10 5 0 0 -5 -5 -10 -10 -15 -15 0 0 20 20 40 40 60 60 min min 12 9 7 13 13 6 8 5 7 12 1 4 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD 6 9 5 2 10 3 8 13 5 11 10 9 7 12 12 2 35 13 30 25 7 3 13 20 15 7 4 6 10 Perfiles de elución de los fenoles en un multipatrón (a,b,c) y extracto de aceite de oliva virgen extra var. picual (d,e,f) a 280nm (a,d), a 320 nm (b,e) y a 360 nm (c, f). 1: Ácido gálico; 2: Hidroxitirosol; 3: Tirosol; 4: Ácido vainílico; 5: Ácido Cafeico; 6: Vainilina; 7: Ácido p-cumárico; 8: Ácido sinápico; 9: Ácido o-cumárico; 10: Rutina; 11: Oleuropeina; 12: Luteolina; 13: Apigenina. 5 0 -5 0 20 40 60 min

10. 3. METODOLOGÍA SEGUIDA PARA LA DETERMINACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS MEDIANTE HPLC-DAD Como se muestra en los cromatogramas, se ha realizado una extracción de los fenoles en las muestras de aceite excelente que nos ha proporcionado los resultados que se muestran en las imágenes. Se realizó la repetitividad y la reproducibilidad del método que se ha descrito y se obtuvieron valores de R.S.D < 10% para la mayoría de los compuestos fenólicos estudiados. Se han podido comparar estos resultados con los obtenidos por los patrones para la identificación y cuantificación de los mismos. Con la numeración señalada en los cromatogramas, se puede observar la identificación de cada fenol en nuestras muestras de aceites gracias al tiempo de retención y al espectro característico que tiene cada uno. M. Becerra, M. L. Pizarro, A. Sayago, M. Beltrán, R. Beltrán,"Comparison of different extraction methods to determine phenolic compounds in virgin olive oil", 13ª Jornadas de Análisis Instrumental, Barcelona, Spain, 14-16 noviembre de 2011.

11. ZONAS DE MUESTREO Picual Arbequina Verdial Olicer Pecoliva Maçanilha Cobrançosa Picual Verdeal Blend

12. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Niebla

13. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Beas

14. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Sanlúcar del Guadiana

15. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes de Gibraleón

16. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Beja (Alentejo)

17. 4. RESULTADOS Tabla .- Contenido de los fenoles individuales de las muestras procedentes del Distrito de Faro (Algarve)

18. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja Con el tratamiento estadístico de los resultados se pretende conocer el comportamiento de muestras con diferentes procedencias y variedades en función de su contenido fenólico. Al realizar un Análisis de Componentes Principales (PCA) inicial con todas las muestras, se observa como las procedentes del Distrito de Faro se diferencian de las procedentes del Distrito de Beja y de Huelva de forma significativa, esto puede ser debido a pequeñas modificaciones llevadas a cabo durante el proceso de análisis o bien a que se tratan de aceites de características muy diferentes al resto en cuanto a su contenido fenólico.

19. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja

20. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.1. Huelva y Distritos de Faro y Beja Del mismo modo, el Análisis Canónico (CA) llevado a cabo teniendo en cuenta todos los fenoles corrobora los resultados obtenidos previamente mediante PCA , donde puede observarse claramente como las muestras procedentes del Distrito de Faro se diferencian notablemente del resto.

21. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja Con el fin de reducir el número de variables, se dispone a realizar un Análisis Discriminante por pasos el cual determina, que con sólo 6 fenoles de los 12 totales se consigue diferenciar los aceites procedentes de Huelva de los procedentes del Distrito de Beja. Siendo los 3 primeros fenoles los más significativos a la hora de diferenciar las muestras procedentes de Huelva de las de Beja dado su reducido valor del p-level (error).

22. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja

23. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.2. Huelva y Distrito de Beja En la figura de la derecha puede observarse como las muestras de Huelva se diferencian perfectamente de las procedentes de Beja tan solo teniendo en cuenta los fenoles clasificados anteriormente, debido entre otros aspectos a la ausencia de los mismos en las muestras procedentes del Distrito de Beja en comparación con los aceites procedentes de Huelva, salvo para la Apigenina donde la tendencia es inversa, tal y como puede apreciarse en los gráficos de la izquierda.

24. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO 5.3. Huelva Para poder diferenciar los aceites procedentes de Huelva en función de la variedad a la que pertenecen (Arbequina, Picual y Verdial), se llevó a cabo un Análisis Discriminante por pasos (SLDA) seguido del correspondiente CA. El Tirosol y la Rutina pueden considerarse los fenoles claves a la hora de clasificar en función de la variedad dado su reducido valor del p-level (error).

25. 5.ESTUDIO ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS 5.3. Huelva El Análisis de Componentes Principales considerando únicamente las variables seleccionadas mediante SLDA (Tirosol, Rutina y Oleuropeina) muestra como las tres variedades se distinguen claramente, siendo la variedad Verdial la más diferenciada del resto, al igual que ocurre en el CA,esto puede ser debido en gran medida a la alta concentración de Tirosol que presenta en comparación con el resto de variedades.

26. Muchas gracias