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｢ 雙鶴頂極靈芝 ｣ 產品之安全性毒理評估. 麥德凱生命科學研究所 麥德凱生科股份有限公司 洪志駿 博士. 食品的機能. 一次機能 ︰ 維持生命所需營養的機能 二次機能 ︰ 味道及香氣等嗜好面的機能 三次機能 ︰ 調節身體功能的生理面機能 ( 保健食品 ; 健康食品 ). Evidence Based Supplements （ EBS ） . 除規定之健康食品評估方法外，一般市售的保健食品多以科學證據為其主要訴求 安全性 效果 客觀的評價. 健康食品從開發到上市 (1). 市 場需求 評估 確定行銷策略 Idea 收集
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｢雙鶴頂極靈芝｣產品之安全性毒理評估 麥德凱生命科學研究所 麥德凱生科股份有限公司 洪志駿 博士
食品的機能 • 一次機能︰維持生命所需營養的機能 • 二次機能︰味道及香氣等嗜好面的機能 • 三次機能︰調節身體功能的生理面機能 (保健食品; 健康食品)
Evidence Based Supplements （EBS） 除規定之健康食品評估方法外，一般市售的保健食品多以科學證據為其主要訴求 • 安全性 • 效果 • 客觀的評價
健康食品從開發到上市(1) 市場需求評估 確定行銷策略 Idea收集 Idea評估．檢討 研發評估 基礎研究．應用研究 研究成果發表 市場需求調查 安定性測試 進行加速性試驗，確立品質規格， 確保品質安定 提出製品概念 產品特徵 題目．目標 試食 打樣試食，意見調查等 藥理效果．生理機能 有效性研究，試驗，專利申請等 產品設計 產品定位、內容量、價格、命名 、容器 、 印刷物、包裝 、型態等． 行銷組合（Marketing mix） 決定產品規格 決定產品規格． 決定容器．包裝．產品作成 打樣 產品分析及規格的訂立 符合經濟規模的數量及成本計算
健康食品從開發到上市(2) 生產計畫，銷售計畫 生產時程，販賣時程提案． 銷售最佳時機的計畫立案 生產 原料檢查，生產線QC， 充填包裝作業等生產及生產管理 銷售策略 行銷通路建立 銷售企劃提案 最終產品 出廠 原料檢查，分析． 依據產品企劃，品質確認後出廠 委託製造申請 認證申請 符號．標記申請 銷售支援 提供銷售服務及支援
『雙鶴頂極靈芝』第2類健康食品評估 實驗委託單位: 勇健工業股份有限公司 試驗樣品名稱:『雙鶴頂極靈芝』 試驗執行單位: 麥德凱生命科學研究所 試驗編號: 0701SA0011: 28天重複劑量亞急性毒性試驗 0701CH0021: 體外染色體結構變異分析試驗 0701MS0031: 沙門氏菌逆突變測試0701MN0041: 動物體內小核分析試驗 試驗執行狀況︰執行完成
健康食品之要件 一、具有明確的保健功效成分，且其產品的合理攝取量必須具有科學依據。中央主管機關對已具有明確保健功能的保健功效成分，應予以公告。 若在現有技術下無法確定有效的保健功效成分，則應列舉具該保健功效的各項原料或佐證文獻，由主管機關評估認定之。 二、經科學化的保健功效評估試驗，或依學理證明其無害且具有明確及穩定的保健功效。 健康食品之保健功效評估方法和毒理學評估方法由中央主管機關訂定之。 健康食品管理法 第3條 (91.1.30修正)
健康食品之安全性試驗 • 第一類：屬下列二種情形之一者，得免再進行毒性測試。（一）產品之原料為傳統食用且以通常加工食品形式供食者。（二）產品具有完整之毒理學安全性學術文獻報告及曾供食用之紀錄，且其原料、組成成分及製造過程與所提具之學術文獻報告完全相符者。 • 第二類：產品之原料為傳統食用而非以通常加工食品形式供食者。 • 第三類：產品之原料非屬傳統食用者。 • 第四類：產品之原料非屬傳統食用且含有致癌物之類似物者。
臨床前試驗-安全性評估 健康食品第2類安全性試驗(靈芝) 1. 基因毒性試驗 -- Gene mutation test with bacteria 沙門氏菌逆突變測試 -- Chromosomal aberration with mammalian cells in culture 動物體內小核分析試驗 -- Micronucleus test with rodents 體外染色體結構變異分析試驗 2. 28天重複劑量亞急性毒性試驗
麥德凱生科股份有限公司 • 聯絡地址:台北縣淡水鎮民權路179-5號2樓 • 馬偕實驗室 :台北縣淡水鎮民生路45號 (馬偕紀念醫院創新育成中心) • 中央試驗室:台北縣淡水鎮中正東路一段3巷 45號7樓 • 電話︰（02）2808-3369 • 傳真︰（02）2808-2567 • 電子郵件︰service@medgaea.com.tw Gaea為希臘神話中的大地之母， MedGaea意味著孕生醫藥的大地。
Our Facility • 馬偕紀念醫院創新育成中心 • 馬偕紀念醫院實驗動物中心 • 麥德凱生命科學研究所淡水中央試驗室 合作機構及指導顧問 • CAP認證實驗室 • 國內外獸醫病理專業教授(毒理試驗) • 國內外藥理相關專業教授(功能性評估)
Animal Center • SPF area for rodent • Clean area for rodent • Rabbit • Beagle and Porcine • Operation room
SPF area for rodent RO water system Air Shower
SPF area for rodent Clean Corridor Operating room in SPF area
基因毒性試驗 基因毒性試驗可分為體內(in vivo)與體外(in vitro)測試，其目的為偵測試驗物質直接或間接引發的基因傷害及程度。一般基因毒性試驗有助於預測試驗物質的致癌性，且有助於致癌性試驗的結果分析。 試驗物質須進行三種以上的基因毒性測試，包括： • 沙門氏菌逆突變測試（Ames test） Gene mutation test with bacteria • 體外染色體結構變異分析試驗 Chromosomal aberration with mammalian cells in culture • 動物體內小核分析試驗 Micronucleus test with rodents
沙門氏菌逆突變測試 評估受測物質是否會引發微生物基因的突然變異
體外哺乳動物細胞染色體異常試驗 以倉鼠之纖維芽細胞(CHL/CHO)評估受測物質之體外基因毒性
齧齒類週邊血液微核試驗 測試試驗物質是否會引發嚙齒類動物網狀紅血球產生微核之情況， 藉以評估試驗物質對染色體或有絲分裂器產生變異之能力
麒麟（KIRIN）巴西蘑菇事件 毒性試驗 （基因毒性及中期多器官致癌性試驗） 試驗機構︰厚生勞動省；日本國立醫藥品食品衛生研究所
28天亞急性毒性口服投予試驗 試驗的目的是在測試試驗物質經28天重複給藥後觀察對大鼠可能產生之毒性影響，了解毒性變化之產生，同時測定無毒性顯示之劑量。本次並提高28天餵食毒性試驗從過去的每天3,000 mg/kg體重到每天5,000 mg/kg體重。 主要觀察項目 體重變化 臨床觀察 食物消耗量 臨床病理 尿液檢測 血清生化學檢測
安全性評估試驗流程 測試物質投予 動物飼養 政府核定之實驗動物管理小組全程監控 試驗計畫 動物犧牲 合格專業之獸醫師以最人道方式進行犧牲 專業研究人員詳盡規劃實驗流程及步驟 無特定病原動物房(Specific Pathogen Free) 經口投藥 組織切片製作 生化性質分析 組織切片觀察及判讀 毒理以及病理判讀 專業醫檢師進行血液·尿液等各種生化分析評估 脫水 染色 切片 血液分析儀 血清生化分析 試驗負責人匯總各研究室實驗數據統合撰寫報告書並經品保室嚴密審核 試驗報告書 組織切片及特殊染色
尿液檢驗（Urinalysis） • 在試驗終止前一天，放置於代謝籠（Labproducts inc, 2100-R, U.S.A.）內16小時（下午17：00至次日上午9：00）。所收集之尿液則進行下列項目之檢查~ a.尿量及飲水量：以代謝籠收集16小時之尿液並量測其飲水量 b.比重：以尿液分析儀（Urisys, Roche, 2400, Germany）測定 c.色調：以尿液分析儀（Urisys, Roche, 2400, Germany）測定 d.定性試驗：以尿液分析儀（Urisys, Roche, 2400, Germany）測定 e.尿沈渣：以一般光學顯微鏡（Nikon Optic, Tokyo, Japan）檢查
血液檢測（Hematology） 實驗動物於口服投予前及犧牲剖檢前，進行採血並以血液分析儀(Automated hematology analyzer, Sysmex Corporation, SF-300, Japan)檢測 白血球數(white blood cell count, WBC count)、 紅血球數(red blood cell count, RBC count)、 血球容積比(hematocrit, Hct)、 平均紅血球體積(mean corpuscular volume, MCV)、 平均血紅素(mean corpuscular hemoglobin, MCH)、 平均血紅素濃度(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC)、 血紅素(hemoglobin, Hb)、 血小板(platelet)、 平均血小板容積（mean platelet volume, MPV）、 淋巴球(lymphocyte)、 嗜中性球(neutrophil)、 單核球(monocyte)、 嗜酸性球(eosinophil)及嗜鹼性球(basophil)百分率(%)等項目。
血液檢測（Hematology） 取血漿(plasma)以血液凝固分析儀(Automated coagulated analyzer, Sysmex Corporation, CA-500, Japan)檢測 前凝血酵素時間(prothrombin time, PT) 部份前凝血酵素原時間(partial thromboplastin time, PTT)等。
血清生化檢測（Clinical chemistry） 實驗動物於口服投予前及犧牲剖檢前，進行採血並做血清生化檢測。動物進行血液採樣前，需禁食8小時以上。血液以3000 rpm離心15分鐘，分離所得之血清以血清生化儀(Automated clinical analyzer, Johnson & Johnson, 5.1-FS, U.S.A.)檢測血清生化值： 麩氨酸氨基轉氨脢(aspartate aminotransferase, AST)、 麩氨酸丙酸轉氨脢(alanine aminotransferase, ALT)、 總膽紅素(total bilirubin)、 尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、 肌氨酸(creatinine)、 肌酸激脢(creatine kinase)、 乳酸脫氫脢(lactate dehydrogenase, LDH)、 總蛋白(total protein, TP) 、 球蛋白(globumin)、白蛋白(albumin)、 鹼性磷酸脢(alkaline phosphatase, ALP)、 麩氨基轉氨脢(-glutamyltranspeptidase, GGT)、 葡萄糖(glucose)、 磷(inorganic phosphorus)、鉀(potassium)、氯(chloride) 及鈣(calcium) 等離子濃度。
組織病理檢驗： 試驗終結，所有動物均經CO2麻醉後犧牲、取體內重要器官組織臟器 (腦、心、肝、腎、脾、睪丸或卵巢)，以10%中性福馬林緩衝液固定保存。若無明顯肉眼病變，選取高劑量組、對照組之體內重要器官 (腦、心、肝、腎、脾、睪丸或卵巢)，以及肉眼檢查發現有病變之組織臟器，以10%中性福馬林緩衝液固定保存後，將組織經粗修、固定、脫水及石蠟浸潤之處理，再以組織包埋機製作成組織蠟塊，以旋轉式切片機切成厚度約為 2~4 µm的石蠟切片，經H&E染色、封片製成組織病理切片，以光學顯微鏡進行組織病理判讀。
試驗數據分析 各組(n=10)實驗數據以平均值（mean）± 標準差（standard deviation, S.D.）來表示。對照組與各劑量組之各種數值，依Duncan test (SPSS, 10.0)進行組間分析。若p值小於0.05則表示有統計學上之顯著性差異。
紀錄保存 所有試驗相關之原始數據、文件、紀錄、試驗計畫書及試驗報告等，將保存於麥德凱生科股份有限公司檔案室。所有紀錄及樣品，將依據麥德凱生科公司規定之保存期限保存5年。委託單位授權人員可於保存期間，依調閱程序提出查閱申請。
28天亞急性毒性口服投予試驗結果(1) • 臨床症狀觀察方面：試驗期間，對照組及各試驗組之雌雄大鼠均無異常臨床症狀。 • 死亡率方面：試驗期間，對照組及各試驗組之雌雄大鼠均未發現死亡。 • 體重變化方面：試驗期間，對照組及各試驗組之雌雄大鼠體重變化均無顯著性差異。 • 飼料攝取量方面：試驗期間，對照組及各試驗組之雌雄大鼠體重變化均無顯著性差異。
28天亞急性毒性口服投予試驗結果(2) • 肉眼觀察病變方面：除在雄鼠低劑量組與中劑量組各有一隻先天性隱睪外，其餘各組之雌雄大鼠體內臟器均無明顯肉眼病變。 • 臨床病理方面：尿液檢驗方面，對照組及各劑量組相較下並無顯著性差異；在血液學、血液凝固及血清生化分析方面，雌雄鼠各劑量組雖有部份檢測項目之數值有差異，但其數值均在臨床正常生理值範圍內。 • 臟器重量方面：雌雄鼠各劑量組雖有部份數值差異，其餘各劑量組之臟器重量與對照組之間均無顯著性差異。 • 組織病理方面：檢查對照組與高劑量組雌雄大鼠各重要臟器均無明顯組織器官與毒性反應相關之病理變化。
結論一 在體外哺乳類細胞染色體結構異常試驗中試驗物質『雙鶴頂極靈芝』，在不含S9作用3小時、20小時以及含S9作用3小時三種方式作用下，使用最高作用濃度5 mg/ml下未具超過50%細胞毒性以及染色體結構異常細胞數與負對照組並無顯著差異。根據以上結果，試驗物質『雙鶴頂極靈芝』，在此試驗濃度下於體外哺乳類細胞染色體異常試驗結果為陰性反應。 體外染色體結構變異分析試驗
結論二 沙門氏菌逆突變測試 在本次沙門氏菌回復突變試驗所設定的條件下，劑量濃度為5、2.5、1.25、0.625及0.3125 mg/plate之試驗物質『雙鶴頂極靈芝』，無論有無經過大鼠肝臟酵素活化過程，五株試驗菌株TA97a、TA98、TA100、TA102及TA1535之回復突變菌落數與負對照組相比較均無顯著性差異，且未達陽性判定標準。所以在本試驗條件下，試驗物質『雙鶴頂極靈芝』於沙門氏菌回復突變試驗(Ames test)之結果判定為陰性反應。
結論三 動物體內小核分析試驗 以『雙鶴頂極靈芝』為試驗物質，測試其對嚙齒類動物體內（in vivo）週邊血液微核發生之比例，藉以評估其直接或間接引發紅血球染色體或有絲分裂器基因變異及造成傷害程度。結果顯示，在臨床觀察及體重方面，並未發現任何毒性症狀及顯著差異。在投予後48小時及72小時之正對照組的網狀紅血球數目均顯著性下降，且網狀紅血球中微核數目亦顯著性增加。『雙鶴頂極靈芝』之各劑量組與負對照組比較並無顯著性差異。綜合以上結果，本實驗數據合於有效性之認定，『雙鶴頂極靈芝』對小鼠週邊血液微核發生之比例均無影響，本試驗判定為陰性反應。
結論四 28天重複劑量亞急性毒性試驗 依據28天餵食毒性試驗，所有動物在血清生化學檢查、組織臟器病理觀察皆沒有看到異常，因此可以判定｢雙鶴頂極靈芝｣每日經口連續餵食大鼠28天之無毒害作用劑量（No-Observed-Adverse-Effect Level, NOAEL）大於每天5,000mg/kg體重。 根據功效實驗，在人體建議用量每人每天服用3.6公克(即為一般大膠囊0.45g/顆x8粒 =3.6公克)，依體重換算時，前述劑量之安全指數為人體建議服用劑量之83.3倍。若建議用量為4顆膠囊時，則高達166.6倍。
總結 由勇健工業股份有限公司委託本公司麥德凱生命科學研究所所執行之健康食品第2類安全性評估實驗，經沙門氏菌逆突變測試、體外染色體結構變異分析試驗、動物體內小核分析試驗及28天重複劑量亞急性毒性試驗各項測試結果，所有基因毒性測試呈陰性反應，且28天重複劑量亞急性毒性試驗之無毒害作用劑量（NOAEL）大於每天5,000mg/kg體重。
敬請指教 麥德凱生命科學研究所 麥德凱生科股份有限公司 台北縣淡水鎮民權路179-5號2樓 TEL: +886-2-28083369 FAX: +886-2-28082567
有兩隻老鼠，交情匪淺。什麼心底話都會和對方分享。這天，老鼠 A 得意洋洋的，拿著一張照片，告訴老鼠B 說：「喂，兄弟，你看你看，我新交的女朋友，很美吧......... 」老鼠B 仔細端詳照片，沉默了很久，然後說：「大哥，你也卡拜託好不好 ........ 那是一隻蝙蝠啊.......... 雖然說我們的臉都 長得差不多，但是，她畢竟不是老鼠啊 .........」老鼠A ：「你到底懂不懂啊..... ㄟ ! 她是空姐 ㄟ.!!」
