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张绍进

蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析. 张绍进. Western Blot 简介 Western Blot 一般流程 Western Blot 常见问题分析. Western Blot 简介：. 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975 年， Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（ NC 膜）上，并利用 DNA － RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。

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Presentation Transcript

  1. 蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析 张绍进

  2. Western Blot简介 • Western Blot一般流程 • Western Blot常见问题分析

  3. Western Blot简介： • 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 • 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。

  4. Western Blot 基本原理

  5. Western Blot 优点 • 高分辨率的电泳技术 • 特异敏感的抗原-抗体反应 • 1-5ng中等大小的靶蛋白

  6. Western Blot应用 • 目的蛋白的表达特性分析 • 目的蛋白与其它蛋白的互作 • 目的蛋白的组织定位 • 目的蛋白的表达量分析

  7. Western Blot 流程 • 蛋白样品的制备 • SDS-PAGE • 转膜 • 封闭 • 一抗杂交 • 二抗杂交 • 底物显色

  8. 蛋白样品的提取 • 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 • 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 • 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 • 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白

  9. 蛋白样品的定量 • 目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、 BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。 • 蛋白质浓度测定的各种方法汇总： http://bbs.bbioo.com/thread-23639-1-1.html

  10. 100mM Tris-HCl(pH6.8) • 200mM DTT • 4%SDS • 0.2%溴酚兰 • 20%甘油 • ddH2O 蛋白样品的变性 • 2×SDS-PAGE上样缓冲液： • DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。 • 按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。

  11. SDS： 阴离子去污剂 变性剂 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。

  12. 蛋白质-SDS胶束的特点： （1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g 蛋白质结合1.4g SDS （3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的 （4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比

  13. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 • 不连续的电泳缓冲体系。 • SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。

  14. 【SDS-PAGE基本原理】 • SDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 • 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 • 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超 过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所 带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基 的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。

  15. 凝胶成分 • 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺  • SDS • 配胶的Tris缓冲液 • TEMED • 过硫酸铵 • Tris-甘氨酸电泳缓冲液

  16. PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体丙烯酰 胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker) N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide， 简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网 状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明 度。是良好的电泳介质。

  17. 聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式： • 单体：丙烯酰胺（Acr）； • 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）； • 催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）； • 加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）； • 产物：三维网状结构凝胶 • 聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(free radicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redox systems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。

  18. 凝胶浓度与蛋白分离范围 SDS-PAGE浓缩胶(5% Acrylamide)及分离胶配方表：http://bbs.bbioo.com/thread-20726-1-1.html

  19. 不连续电泳： 电泳缓冲液：pH8.3 Tris-甘氨酸系统。

  20. 灌制分离胶 隔绝空气 ddH2O 0.1%SDS:<8% 异丁醇：>8%

  21. 灌制积层胶 插入梳子

  22. Staking gel Separating gel

  23. 转膜 • 要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。 • 常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。

  24. 转移膜的选择 • 最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。 • 各种膜的详细特点介绍： • http://www.bbioo.com/bio101/2008/21461_2.htm

  25. 湿转系统

  26. 半干转移系统

  27. 转膜后检测（此步可以省略） • 丽春红染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤 维素滤膜，换水几次。 • 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探 针的Western印迹过程。

  28. 封闭 • 为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。 • 5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h） • Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司） • Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。

  29. 一抗、二抗孵育 • 把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 • 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 • 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。 • 回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。 • 最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。

  30. 二抗与底物反应显色 • 辣根过氧化物酶法（HRP） • 碱性磷酸酶法（AP） • 化学发光显色法(HRP)

  31. 膜解吸方法（膜的重复利用） • 通过加热和去污剂进行解吸 原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。 • 酸解吸 原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。

  32. Western Blot结果分析 • 目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。 • Western Blot结果分析软件Gel-Pro Analyzer 4 绿色版（附动画演示教程）http://bbs.bbioo.com/thread-44929-1-1.html

  33. Western Blot常见问题分析

  34. SDS-PAGE电泳 • 胶板洗刷干净 • 加入AP和TEMED的量要合适 • 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 • 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 • 两块玻璃板底部要对齐 • 胶不平？ • 凝胶漏液？

  35. SDS-PAGE电泳 • 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 • 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲 • 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度 • 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适 • 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑”条带？

  36. 转膜及抗体检测 • 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min • 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸 • 确保膜和胶块之间没有气泡 • 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 • 凝胶肿胀或卷曲？ • 条带歪斜或漂移？ • 单个或多个白点？ • 转膜缓冲液过热？

  37. 蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜蛋白分子量<10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜 • 更换高pH值Buffer • 在阴极buffer中加入0.005 - 0.01% SDS 可提高转膜效率 • 延长转膜时间 原因 • 蛋白分子量<10KD • 蛋白的等电点< 9 • SDS浓度不合适 • 凝胶太厚 对 策 转移到膜上的蛋白很少

  38. 原因 • 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 • 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 • 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 • 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 • 膜没有均匀浸湿 • 膜或者缓冲液污染 • 封闭不充分 • 抗体与封闭剂出现交叉反应 • 抗体浓度过高 对 策 背景太高

  39. 原因 • 抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测 • 增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照 • 减少漂洗的时间和次数 对 策 • 抗体保存不当 • 抗原不充足 • 膜的漂洗过度 杂交信号很弱

  40. 原因 • 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 • 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 • 一抗不是唯一特异的 • 二抗出现非特异结合 对 策 出现非特异带

  41. Further Readings • 生物秀Western Blotting专题 • http://ask.bbioo.com/special/experiment/WesternBlotting.htm • Millipore的蛋白印迹手册 • http://bbs.bbioo.com/thread-45770-1-1.html • Bio-Rad的western Blotting操作手册 • http://bbs.bbioo.com/thread-30154-1-1.html • Western blot问题解答专帖 • http://bbs.bbioo.com/thread-40769-1-1.html

  42. 谢谢大家！

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