Kmenové buňky

1. 2013 Marek Vácha Kmenové buňky

2. Kmenové buňky mají tři charakteristické rysy: 1. jsou nediferencované 2. v tomto nediferencovaném stavu se mohou dlouhou dobu rozmnožovat 3. za jistých podmínek mohou dávat vznik specializovaným buňkám, jako jsou nervové buňky, svalové buňky, buňky produkující insulin, atd. (známo přes 200 buněčných typů v lidském těle)

3. Kmenová buňka • 1. Není terminálně diferencovaná (není tedy na konci cesty vedoucí k diferenciaci) • 2. Může se dělit bez jakéhokoli limitu (nebo přinejmenším do smrti zvířete) • 3. Když se rozdělí, každá z dceřinných buněk má volbu: buď může zůstat kmenovou buňkou, nebo nastoupí cestu vedoucí k terminální diferenciaci) • (Alberts, B., Jonnson, A., Lewis, J., et al. (2002) Molecular Biology of The Cell. 4th ed. Garland Science. New York.)

4. Obraz vytvořený Conradem Waddingtonem představuje epigenetickou krajinu. Cesta kuličky znázorňuje různé osudy buněk. C.H. Waddington: Organisers & genes. Cambridge University Press, 1940

5. embryonální kmenové buňky

6. Kmenové buňky • byly poprvé isolovány z myší v roce 1981. • Embryonální kmenové buňky člověka byly poprvé isolovány v roce 1998 • Dr. James Thomson, Wisconsin university financováno z Geron corporation). • Dr. John Gearhart of JohnsHopkins University James A. Thomson říká že přemýšlel "dlouho a usilovně" než přistoupil k výzkumu na embryonálních kmenových buňkách

7. Thomson a Gearhart použili odlišné metodiky, avšak oběma se zdařilo isolovat velmi rané prekursorové buňky a aplikovali je na vrstvu myších feeder buněk, čímžto získali kulturu nesmrtelných lidských pluripotentních kmenových buněk. James Thomson (vlevo) a John Gearhart (vpravo)

8. James A. Thomson (2007) • ...jeho laboratoř je jednou ze dvou na světě, která zvládla proces přeměny buněk kůže na kmenové buňky s parametry velmi podobnými, jaké mají embryonální kmenové buňky. • Pravda je, řekl Dr. Thomson v rozhovoru, že měl etické obavy z výzkumu na embryích od počátku, navzdory jistotě, že takovýto výzkum vnese nové světlo do vývoje člověka a má v sobě potenciál pro nové léčby nemocí. • "Pokud vám z výzkumu na lidských embryonálních kmenových buňkách není alespoň trochu nevolno, pak jste o něm ještě dostatečně nepřemýšleli." • “If human embryonic stem cell research does not make you at least a little bit uncomfortable, you have not thought about it enough,” • “Přemýšlel jsem dlouho a usilovně o tom, zda bych měl do výzkumu jít." • (New York Times, 22. 11. 2007)

9. Embryonální kmenové buňky

10. Embryonální kmenové buňky Embryonální kmenové buňky, které se budou v kultuře rozmnožovat 6 nebo více měsíců aniž by se diferencovaly, které si zachovaly schopnost pluripotence a zdají se býti geneticky normální jsou považovány za linii embryonálních kmenových buněk

11. iPSCs - Indukované pluripotentní buňky

12. 2012: ShinyaYamanaka získává Nobelovu cenu Shinya Yamanaka a John Gurdon

13. Shinya Yamanaka • původním vzděláním lékař, nejprve klinik, pak ortopedický chirurg • cíl: nalézt cestu, jak diferencovaných buněk vytvořit pluripotentní kmenové buňky. • Yamanaka začal se seznamem 24 genů, které se zdály důležité u embryonálních kmenových buněk

14. Yamanaka se rozhodl testovat nejrůznější kombinace těchto genů s (velmi malou) nadějí, že se zdaří najít sestavu, která diferencovanou buňku přemění v pluripotentní • základní výzkum na myších • s použitím genu neoR pro rezistenci k neomycinu. Gen se exprimoval pouze u pluripotentních buněk • Oct4, Sox2,Klf4,c-Myc • savčí buňka obsahuje kolem 20 000 genů a je neuvěřitelné, že pouhé čtyři z nich přemění plně diferencovanou buňku v pluripotentní.

15. Shinya Yamanaka a jeho postdoc Kazutoshi Takahashi

16. 2012: ShinyaYamanaka získává Nobelovu cenu • „Zasluhuje si nejen Nobelovu cenu za medicínu, nýbrž rovněž Nobelovu cenu za etiku.“ • (Julian Savulescu, Uehiro Chair in Practical Ethics & Director, Oxford Uehiro Centre for Practical Ethics) • “Je to vzácný příklad vědeckého objevu, který může vyřešit víc etických problémů než vytvoří.“ • Mnoho etických námitek vůči výzkumu na kmenových buňkách se soustředilo na fakt, že zde dochází k destrukci lidských embryí. iPS cell technologie vědcům umožňuje obejít tyto námitky tím, že vytvoří oluriopotentní kmenové buňky z tkání dospělého člověka. • Ovšem pro tuto chvíli se domnívám, že výzkum na iPS buňkách musí běžet paralelně s výzkumem na embryonálních kmenových buňkách.“ • (Dr Tom Douglas, Wellcome Trust Research FellowOxford Uehiro Centre for Practical EthicsUniversity of Oxford)

18. iPSC • = indukované pluripotentní kmenové buňky • přidáním pouhých 4 genů do buněk lidské kůže byli výzkumníci schopni přeprogramovat tyto buňky zpět do stavu podobnému stavu raného embrya. • Shinya Yamanaka • buňky mají schopnost se vyvinout do jakéhokoli buněčného typu těla člověka

19. iPS • iPS tak možná poslouží jako zdroj imunologicky kompatibilních buněk použitelných pro pacienty, trpící v tuctu chvíli těžko léčitelnými chorobami jako je např. Alzheimerova choroba, aniž by nastal jakýkoli etický problém spojený s využíváním embryonálním kmenových buněk nebo cybridů.

20. iPS cells: potenciální využití • pacienti, trpící nějakou nemocí, mohou poskytnout své vlastní buňky, které následně budou repreogramovány do iPS buněk, které mohou sloužit jako • modelové buňky pro porozumění dané chorobě a případné terapii • pacientovy vlastní buňky mohou být reprogramovány do iPS a pak použity jakožto náhrada nefunkčních tkání • linie lidských iPS buněk již existují od pacientů trpících nemocemi jako je diabetes prvního typu, Parkinsonova choroba a tucet dalších

21. tato technologie již byla úspěšně použita u myší trpících srpkovitou anémií (tyto myši byly pomocí technik genového inženýrství upraveny, aby touto nemocí trpěly)

22. díky výzkumu několika laboratoří se ovšem v současnosti ukazuje, že existují přece jen rozdíly mezi iPS a ES buňkami, zejména co se týče genové exprese a dalších buněčných funkcích, jako je buněčné dělení. • přinejmenším do té doby, dokud tyto rozdíly nebudou plně pochopeny bude zřejmě pokračovat výzkum na ES buňkách (a pravděpodobně i po té) • (Reece, J.B., Urry, L.A., (2011) Campbell Biology. 9th. ed. PearsonPublication, Inc. , New York. p. 462)

23. Klasifikace • (ESC)Human embryonic stem cells, které se dají získat z lidského embrya ve stadiu blastocysty (4-5 den po oplození) 5. den obsahuje blastocysta asi 100 buněk, ICM tvoří 30 z nich • (FSC)Human embryonic germ cells, které mohou být izolovány z primordiálních zárodečných buněk (primordial germ cells) plodu. Získávají se z plodu ve stáří 5 – 10 týdnů. Jedná se o buňky, ze kterých by se normálně vyvinuly gamety. U spontánních abortů není etický problém. U vyprovokovaných potratů je: nebezpečí dělání potratů jen proto. • (ASC)Human somatic stem cells, které mohou být izolovány z dospělého člověka nebo z tkání plodu nebo z krve pupeční šňůry. V těle člověka je asi 20 druhů těchto kmenových buněk (nervové, hematopoietické atd.)

25. Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace • Progenitorové kmenové buňky – nakonec z nich vznikne pouze jediný buněčný typ. Např. epidermální kmenové buňky dají vznik keratinocytům a spermatogoniální kmenové buňky dají vznik spermiím • Multipotentní kmenové buňky – dají vznik několika buněčným typům, ze kterých může vzniknout tkáň nebo orgán. Příkladem jsou kmenové buňky kůže, ze kterých vzniknou epidermální buňky, mazové žlázy a vlasové folikuly. Z hematopoietických kmenových buněk různé typy krvinek (erytrocyty, lymfocyty atd.) Z neurálních kmenových buněk vzniknou všechny buněčné typy nervového systému (gliové buňky a mnoho typů neuronů)

26. Embryonální kmenové buňky

27. Multipotentní kmenové buňky

28. Druhy kmenových buněk podle schopnosti diferenciace • Pluripotentní kmenové buňky – jsou schopny dát vznik všem odlišným buněčným typům in vitro. Nemohou ale dát vznik embryu. Mohou být izolovány buď z germ cells plodu, pak hovoříme o EG cells, nebo z ICM, pak se jedná o ES cells. Nevyskytují se přirozeně v těle, což je odlišuje od progenitorových buněk a multipotentních buněk • Totipotentní kmenové buňky – u člověka jen zygota a snad první blastomery (2,4,8?)

29. pluripotentní (literárně) = "schopná dělat mnoho mnoho věcí "

30. každá z blastomer (2,4,8 buněk raného embrya) je považována za buňku schopnou vytvořit celé nové embryo, včetně trophoblastu • isolované ICM buňky pravděpodobně již nejsou schopny trophoblast vytvořit

31. Embryonální kmenové buňky

32. Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk • Nadbytečná embrya. Jedná se o embrya vytvořená pro potřeby IVF a následně nepoužitá. V zemích kde je povolena preimplantační diagnostika se může jednat o kmenové buňky z embryí, které byly zavrženy v souvislosti s PID. Všechny tyto embrya mohou být použita k výzkumným účelům, dají–li rodiče informovaný souhlas. Odstraní se trofoblast a buňky ICM jsou vloženy na vrstvu myších fibroblastů • Embrya vytvořená metodou IVF pro výzkumné účely a pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Jsou tedy vytvořeny splynutím lidské spermie a lidského vajíčka.

34. Možné zdroje lidských embryonálních kmenových buněk • Embrya vytvořená metodou SCNT pro výzkumné účely nebo pro účely obstarání embryonálních kmenových buněk. Je to výhodné proto, že při tomto terapeutickém klonování bychom se vyhnuli problému s imunitní odpovědí organismu. • Další možnosti. Možná by se daly rovněž získat kmenové buňky injekcí cytoplazmy z lidského vajíčka či lidské kmenové buňky do nějaké diferencované buňky lidského těla. (ovoplasmický transfer). Eventuelně by šlo přeprogramovat i normální somatické buňky, aby se začaly chovat jako stem cells.

35. Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk • Tkáně a orgány dospělého člověka. Kmenové buňky kostní dřeně se dají získat invasívní intervencí, např. procedurou spojenou s darováním kostní dřeně. Rovněž bylo publikováno obdržení kmenových buněk po autopsii, z post mortem  mozkové tkáně • Tkáně a orgány plodu – tkáně a orgány získané z plodů po ukončení těhotenství, zejména neurální kmenové buňky z mozkové tkáně. Asi 400 pacientů ve Švédsku a USA léčeno proti Parkinsonově chorobě. Do každé hemisféry dostali tkáň ze 6 – 8 plodů

36. Možné zdroje lidských somatických kmenových buněk • Krev z pupečníkové krve – hematopoietické kmenové buňky mohou být obdrženy z krve pupeční šňůry při porodu. V této krvi mohou být rovněž i další kmenové buňky. Je zde ovšem jen malé množtví buněk. • cena 40 000 – 50 000 Kč • buněk je tak málo, že se dají použít jen pro děti do cca 5 let max. • dítě nesmí mít akutní leukémii a samozřejmě žádnou jinou, např. genetickou chorobu (kterou mají pochopitelně i SC) • mohlo by to fungovat max. pro pevné nádory u dítěte do stáří cca 2 roky – to ale skoro nikdy nemá

37. Využití kmenových buněk • terapeutické koncepty • ve farmakologii a toxikologii • genové terapie (v případě leukémií, pokud bychom do SC vložili vhodný gen) • porozumění ontogenetického vývoje člověka • porozumění základním mechanismům diferenciace a proliferace

38. Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky • výhody • jsou pluripotentní • hES cells jsou zatím jediné kmenové buňky které se dají snadno získat a pěstovat v dostatečné množství

39. Výhody a omezení lidské embryonální kmenové buňky • omezení • největší problém je v imunitní odpovědi. Protože nemohou být získány přímo z pacienta, je zde vždy risk imunologické odpovědi. • protože mají tak velký potenciál, bude zřejmě obtížné je uhlídat, aby se nediferencovaly v nežádoucí typ tkáně, eventuálně aby z nich nevznikl tumor. • současné metody umožňují pěstování těchto buněk pro výzkumné účely, avšak pokud jsou jako feeder buňky použity myší fibrocyty, je vyloučeno používat za těchto podmínek lidské ES buňky k transplantacím

40. Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky • výhody • potenciál je mnohem větší než se myslilo • mohou se užít pacientovy vlastní kmenové buňky a tím bychom se vyhnuli problému imunitní odpovědi. • v budoucnosti bychom mohli léčivy povzbudit pacientovy vlastní kmenové buňky přímo in situ.

41. Výhody a omezení lidské somatické kmenové buňky • omezení • isolace, růst a diferenciace je stále komplikovanější než u embryonálních. • pokud trpí pacient genetickou chorobou či sklony k rakovině, to vše se přenese i do kmenových buněk, což omezuje jejich možnosti v léčení např. diabetu. • dospělé kmenové buňky již mohou mít poškozenou DNA díky slunečnímu záření, toxinům a chyb při replikaci

42. Příklady terapií, u kterých v současnosti probíhá intenzivní výzkum • Neurologické nemoci (Parkinsonova choroba, Alzheimerova choroba) • poranění míchy • roztroušená skleróza • selhání srdce • diabetes • popáleniny • různé typy rakoviny (např. leukémie) • svalová dystrofie

43. další poznámky

44. Kmenové buňky napodobují lidský mozek„The big surprise was that it worked“ • Tento kapkovitý útvar vyrost natolik, že začal připomínat mozek foetu v devátém týdnu vývoje. • buňky jsou odvozeny z buněk kůže • shluk nervových buněk velikosti hrášku by se mohl ukázat důležitým při výzkumu lidských neurologických onemocnění. • tato kulička buněk ovšem postrádá kapiláry, což může být důvodem, proč má jen 3-4 milimetry v průměru, i když roste 10 měsíců či více. srpen 2013 http://www.nature.com/news/stem-cells-mimic-human-brain-1.13617

45. Dr. Woo Suk Hwang • 24. listopadu 2005 Dr. Hwang resignuje, neboť je mu prokázáno, že • za některé oocyty bylo placeno • některé oocyty byly brány od jeho postgraduálních studentek • dvě ze tří prací v Science byly podvodné • 2012: Dr. Hwang hodlá naklonovat mamuta V srpnu 2005 byl naklonován pes

46. V roce 2001, výzkumná skupina v Massachusetts získala touto technikou několik prvních buněčných dělení v tomto typu experimentu • O několik let později, výzkumná skupina ze Soulu v Jižní Korei publikovala vytvoření klonovaných lidských embryí až do stadia blastocysty... • ...avšak tito vědci byly později shledáni vinnými z podvodu a vymýšlení dat

47. Cybridi • ve Velké Británii byly registrovány (2007) žádosti tří výzkumných týmů pro licencování použití králičích, kravích a kozích oocytů za účelem vytvoření embryí cytoplazmatických hybridů, tzv. cybridů. • návrh, podporován komunitou výzkumníků, vyústil ve fakt, že HFEA dala "v principu souhlas" s použitím této technologie (2007)

48. Cybrids

49. legislativa

50. historie - USA