食品微生物实验

1. 食品微生物实验

2. 实验一 培养基的配制、分装和灭菌

3. 1 2 3 5 7 4 6 目录 实验目的 实验原理 实验器材 实验方法 实验结果 注意事项 思考题

4. 明确培养基的配制原则； 掌握配制培养基的一般方法和步骤； 了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围； 掌握高压蒸汽灭菌技术，了解几种常用灭菌方法。 实验目的

5. 培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基.培养基是按照微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的各种营养物质，用人工方法配制而成的一种基质。它包括碳源、氮源、能源、生长因子、无机盐和水六类营养要素。由于不同微生物细胞组成不同，因而所需营养基质不同，为了分离、培养和鉴定不同的微生物，必须根据其需要，配制合适的培养基. 培养基的种类繁多，根据培养基的成分、物理性状不同，可分为天然培养基、合成培养基、半合成培养基、固体培养基、半固体培养基和液体培养基 实验原理

6. 灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。灭菌是指应用物理或化学的方法，杀灭物体表面和内部一切微生物营养体、芽孢和孢子。灭菌方法很多，可分为加热、过滤、照射和化学药品法等。 常用加热灭菌法 1、干热灭菌： 用火焰烧灼或电热干燥箱内高温热空气灭菌 2、湿热灭菌 高压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法、煮沸消毒法 实验原理

7. 实验器材 1. 药品和试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％ NaOH 溶液、10％盐酸溶液。2. 器材天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、 PH试纸、试管、三角瓶、分装漏斗、牛皮纸、棉花、线绳、干燥箱、高压锅。

8. 实验方法 培养基的制备过程称量---溶解----调节pH值----过滤----分装及包扎----灭菌----灭菌后试管摆放斜面 1. 称量按照培养基配方，准确称量各成份放于瓷缸中。 配方：牛肉膏5.0 g,蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g, 琼脂 20.0 g,蒸馏水 1000 ml, pH 7.0。

9. 2.溶解 向上述瓷缸中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水分。 3.调节pH值 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠和盐酸调节PH。 实验方法

10. 4.过滤 用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。 5.分装及包扎 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。 实验方法

11. 实验方法 6.灭菌：高压蒸汽灭菌，1210C灭菌20分钟。

12. 实验方法 7. 灭菌后试管摆放斜面

13. 实验方法

14. 称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品； 蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速； 配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时， 再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，要求 不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢； 分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量 约为管高的1/5，液体培养基约为管高的1/4，三角瓶不 超过瓶体的1/2 ； 分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。 注意事项

15. 1. 思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？ 2. 为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？ 思考题

16. 实验二 环境微生物的监测和菌落识别

17. 1. 掌握各种微生物接种的基本操作技术； 2. 初步了解周围环境中微生物的分布状况； 3. 熟悉四大类微生物菌落的形态特征。 实验目的

18. 在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，就可以进行鉴别。在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们在适宜的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，就可以进行鉴别。 接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物的纯种移接到适合微生物其生长的新鲜培养基中或生物体内的一种操作过程，实验室常用的接种方法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。 实验原理

19. 菌种 实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。 2. 培养基 马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基 3. 器皿 无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。 实验器材

20. 1. 斜面接种 实验方法

21. 2. 液体接种 由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。 将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接、触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。 实验方法

22. 3.穿刺接种 用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出，此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。 4.平板接种 将菌种接至培养皿的方法，平板接种的目的是观察菌落形态、分离纯化菌种，活菌计数以及在平板上进行各种试验时采用的一种接种方法，可分为下面几种：  实验方法

23. 1) 斜面接平板 a. 划线法：见平板划线分离法。 b. 点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）。  2) 平板接斜面：一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。  实验方法

24. 实验方法 环境微生物的检测 1） 空气 做实验室空气中微生物的检测时，只要打开无菌平板的皿盖，让其在空气中暴露一段时间（5-10min），即让空气中含微生物的尘埃或微粒以沉降法自然接种到平板培养基的表面，然后将皿盖盖上即可。 2） 桌面 在做实验桌面的微生物检测时，可用一枚无菌棉签，先在手持无菌平板的半侧润湿后划数条“Z”型的接种线，以此作为无菌棉签试验的无菌对照区域。然后仍用此棉签去擦抹桌面，再在平板的另半侧的表面作同样的划线接种。上述操作均应以无菌操作法进行，即在火焰旁的无菌操作区域内完成。

25. 3）头发 移去无菌平板的皿盖，使自己的头发部位保持在平板培养基的上方，然后以手指拨动头发数次，再盖上皿盖，就可以粗略测知头发中所含带菌尘埃的多少及其含菌的种类等。 4）手指 可用未经清洗的手指先在无菌的平板培养基的左半侧作划线接种，并在皿底做好标记。然后用肥皂洗手，待手指冲洗干净后再在平板培养基的另半侧作同样的划线接种，然后盖好皿盖。待培养后比较平板两侧所形成的菌落或菌苔的差异来判断手指的含菌量。 实验方法

26. 5）口腔 打开无菌平板培养基的皿盖，使口对着平板培养基的表面，以咳嗽或刺激鼻腔打喷嚏方式接种；也可用长的无菌棉签从口腔或咽喉等处取菌样，然后在平板表面作划线分离，再盖上皿盖，经培养后观察平板上的菌落或菌苔。 培养 将以上各种检测平板倒置于28℃温箱中培养，至下周实验时观察并计数各平板上的菌落数。若有时间，可从24h起观察数次，以了解各种平板及不同类型菌落出现的顺序及菌落大小、外形和颜色等的变化。 实验方法

27. 实验结果 放线菌 酵母 细菌 霉菌

28. 用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（50-60℃为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。用于倒平板的培养基一定要彻底溶化，否则会在所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（50-60℃为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。 在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指，同时，手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操作污染等。 注意事项

29. 1. 在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝? 2. 酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别? 思考题

30. 实验三 微生物的纯种分离法

31. 1. 了解平板划线法分离菌种的基本原理及操作； 2. 了解用浇注平板法和涂布平板法分离微生物纯种的原理及操作。 实验目的

32. 自然界中，绝大多数微生物都是混杂生活在一起的，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。自然界中，绝大多数微生物都是混杂生活在一起的，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离出它，以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。 一般根据该微生物营养、培养特点、对某种抑制剂的耐受性不同及对某种环境条件要求不同，制作或设置一些选择性培养基及选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。 实验目的

33. 样品 土样 2. 培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、豆芽汁培养基。 3. 其它 盛9ml无菌水的试管、盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。 实验器材

34. 图14-1 从土壤中分离微生物操作过程 实验方法 1、稀释混合平板法

35. 1）平板制作 用1ml无菌吸管吸10-6 、10-5 、10-4稀释液各1ml，分别放入培养皿中，每一梯度做三个培养皿。然后在9个培养皿中分别倒入15ml已融化并且冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整个操作过程应严格按照无菌操作。 实验方法

36. 2）培养与移植 待平板完全冷凝后，将平板倒置37℃恒温箱中培养24～48小时，检查分离结果。将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到牛肉膏蛋白胨斜面上，置于37℃恒温箱中培养，菌苔长出后，检查是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其它杂菌混杂，再一次进行分离、纯化，至获得纯培养。 实验方法

37. 2、稀释涂布平板法 此法与稀释混合平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先将培养基融化，注入培养皿，摇匀后制成平板，然后吸10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，然后分别倒置于28℃和37℃温箱中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。 实验方法

38. 实验方法 3、平板划线分离法

39. 实验结果

40. 用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角宜小些，动作要轻巧，以防划破平板。 用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。 平板不能倒得太薄，最好在使用前一天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。 注意事项

41. 1．在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于1．在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于 哪个类群？简述它们的菌落形态特征。 2．稀释分离时，为什么要将融化的琼脂培养基冷却到 45～50℃左右才能倾入装有菌液的培养皿内？ 3．划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的 菌体烧掉？划线为何不能重叠？ 4．培养时为什么要将培养皿倒置培养？ 思考题

42. 实验四 细菌染色法和光学显微镜的使用

43. 1. 巩固和掌握显微镜油镜的正确使用； 2. 学习细菌制片和单染色技术； 3. 观察细菌的三种基本形态； 4. 学习细菌的革兰氏染色原理和方法 。 实验目的

44. 1. 油镜物镜的工作原理 实验原理 • 使用油质作为玻片与接物镜之间的介质——油浸系可以增加显微镜的放大倍数可以增加视野的照明度可以增大显微镜的分辨率

45. 实验原理 油镜头的识别和重要参数 放大倍数 数值口径 工作距离

46. 2. 革兰氏染色原理 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。 实验原理

47. 实验器材 • 1. 活材料 • 培养24小时的大肠杆菌金黄色葡萄球菌。 • 2. 染色液和试剂 • 结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红 、蒸馏水、香柏油。 • 3. 器材 • 载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微 • 镜。

48. 1.革兰氏染色 （1）涂片 （2）晾干 （3）固定 （4）结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂面）的结 晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用 水小心地冲洗。 （5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。 实验方法

49. （6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色 15—20s至流出液无色，立即水洗。 （7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去涂 片上的复红染色液。 （8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。 （9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结果。 实验方法

50. 2. 油镜的使用方法 （1）用低倍镜对光。最大光圈 （2）低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈 （3）高倍镜观察（选取理想的观察目标）。 （4）油镜观察：高倍镜观察后- 上升镜筒-油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈 实验方法